一種非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法

馬浩鑫 朱桂達(dá) 張曉霞 楊若男 謝雨婷 劉小澤 王報(bào)貴

摘要 [目的]建立一種由高脂高糖膳食導(dǎo)致小鼠患非酒精性脂肪肝病的方法，具體癥狀為伴有嚴(yán)重血脂異常、肝功能受損和炎癥反應(yīng)。[方法]選用SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，7～8周齡，采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組和模型組，每組20只，模型組灌胃高脂高糖腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液，正常組灌胃PBS，試驗(yàn)期間自由攝食基礎(chǔ)飼料和水。于第10、12、14、16周分別處死3只小鼠，檢測(cè)是否達(dá)到NAFLD脂變程度;16周后，處死全部小鼠進(jìn)行常規(guī)血脂4項(xiàng)和肝功能檢測(cè);觀察肝臟的外觀，測(cè)定肝臟中TG和TC含量;另取肝臟、脾臟和腹部脂肪分別進(jìn)行HE染色;測(cè)定血清中IL-6和TNF-α水平。[結(jié)果]隨著灌胃時(shí)間的增加，模型組肝臟系數(shù)、TG、TC含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)，正常組對(duì)應(yīng)指標(biāo)變化不明顯;當(dāng)灌胃時(shí)間達(dá)到12周時(shí)，模型組肝臟TC含量顯著高于正常組;14周時(shí)，模型組中TG、TC含量與正常組相比均顯著增加;通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，灌胃16周時(shí)模型組肝細(xì)胞排序混亂，肝細(xì)胞脂肪嚴(yán)重;血液中炎癥因子和肝功能水平顯著高于正常組，說(shuō)明灌胃高脂高糖腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液16周，模型組內(nèi)肝脂變嚴(yán)重，肝細(xì)胞損傷并出現(xiàn)明顯的炎性病變。[結(jié)論]該研究建立NAFLD小鼠模型操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)的指標(biāo)穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高且更接近模擬人類該疾病的自然發(fā)病規(guī)律，為建立深入研究NAFLD發(fā)病機(jī)制、相關(guān)防治措施和治療藥物的篩選提供了可靠的動(dòng)物模型。

關(guān)鍵詞 非酒精性脂肪肝;脂質(zhì)沉積;炎癥因子;高脂高糖飲食

中圖分類號(hào) R-332 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）14-0080-05

Abstract [Objective] A method of nonalcoholic fatty liver disease in mice caused by a highfat，highsugar diet was established，specifically with severe dyslipidemia，impaired liver function，and an inflammatory response.[Method] SPF male C57BL/6J mice （78 weekold） were selected and divided into normal and model groups by random number method，with 20 mice in each group.Mice in model group was fed with high fat and high glucose enteral nutrition，mice in the normal group was fed with PBS.Mice were freely fed with the basal diet and water during this period.Three mice were killed at 10，12，14，and 16 weeks respectively to determine whether NAFLD lipid change was achieved. All mice were killed after 16 weeks for routine lipid 4 tests and liver function tests.The appearance of the liver was observed，and the contents of TG and TC in the liver were measured.Furthermore，liver，spleen，and abdominal fat were taken for HE staining.IL6 and TNFα levels in the serum were determined.[Result]The liver coefficient，TG and TC contents in the model group gradually increased with the increase of the gastric irrigation time，and the corresponding indices in the normal group did not change significantly.When the gastric irrigation time reached 12 weeks，TC content in the liver of the model group was significantly higher than that in normal group.At 14weekage，the contents of TG and TC in the model group were significantly increased compared with the normal group.The results of HE staining revealed that the liver cells in the model group were disordered and intrahepatic cells are severely fat.The levels of inflammatory factors and liver function in the blood were significantly higher than those in the normal group.These indicated that the intragastric highfat and highsugar enteral nutrition solution was administered for 16 weeks.The liver lipids in the model group became severe，and the hepatocytes were damaged with obvious inflammatory lesions. [Conclusion]The establishment of NAFLD mouse model was easy to operate，and the indicators tested were stable，highly reproducible，and closer to stimulate the natural occurrence of the disease in humans.The research results provided a reliable animal model for the indepth study of the pathogenesis of NAFLD，related prevention and treatment measures and the screening of therapeutic drugs.

Key words Nonalcoholic fatty liver;Lipid deposition;Inflammatory factors;Highsugar and highfat diet

基金項(xiàng)目 山東省創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202010449007）;濱州學(xué)院博士科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2018Y18）。

作者簡(jiǎn)介 馬浩鑫（2000—），女，山東濱州人，研究方向：食品質(zhì)量與安全。*通信作者，講師，從事食品（含生物質(zhì)）資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

收稿日期 2020-11-23

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，以三酰甘油（又名甘油三酯，triglyceride，TG）在肝細(xì)胞沉積為主要特征，疾病譜包括非酒精性肝脂肪病變、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。近年來(lái)，隨著高熱量飲食（高糖高脂類）的過(guò)多攝入、久坐少動(dòng)的工作方式、社交應(yīng)酬增多和人均壽命的延長(zhǎng)，致使肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）的流行，導(dǎo)致NAFLD已成為導(dǎo)致我國(guó)第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生物化學(xué)指標(biāo)的首要原因。

橫斷面研究[3]顯示，全球有西方膳食習(xí)慣的成人中，20%～30%的成人存在肝臟過(guò)量脂肪沉積，2%～5%的NAFLD患者存在明顯的肝臟損傷，1%～2%的成人存在患NASH導(dǎo)致肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)，目前已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)有學(xué)者調(diào)查了6 450名職業(yè)人群NAFLD的患病率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD的患病率為21.71%，男性為28.68%，女性為14.47%，表明NAFLD在我國(guó)廣泛流行的嚴(yán)峻形勢(shì)。與單純的脂肪變性相比，炎癥反應(yīng)是NASH必需的病理特征[4]。NAFLD嚴(yán)重程度與IL-6的表達(dá)水平呈正相關(guān)，TNF-α促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移至肝臟組織，增強(qiáng)肝臟局部炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致NAFLD疾病的發(fā)生。NASH作為NAFLD較嚴(yán)重的進(jìn)展階段，發(fā)病常常伴隨全身MetS，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肝臟脂肪堆積、炎癥反應(yīng)和纖維化。臨床研究[5]表明，NASH患者10年內(nèi)肝硬化和肝癌發(fā)生率高達(dá)25%，預(yù)計(jì)NASH將成為未來(lái)10年肝移植的主要原因。

為深入研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制，建立一個(gè)與人類病變相似的動(dòng)物模型極為重要。然而，目前國(guó)內(nèi)外的NAFLD動(dòng)物模型缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一定程度上限制了NAFLD病理機(jī)制及治療藥物的深入研究。

在多種造模方式中，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型在發(fā)病機(jī)制上與人類最為相似，且多伴有肥胖、胰島素抵抗等代謝綜合征的表現(xiàn)[6]。目前國(guó)內(nèi)外主要采用高脂飼喂Wistar或SD大鼠，或者膽堿-蛋氨酸缺乏飲食（MCD） C57BL/6J小鼠模型，其中C57BL/6J小鼠對(duì)高脂較為敏感[7-8]。前者炎癥的產(chǎn)生和造模時(shí)間較長(zhǎng)，后者可以較快復(fù)制模型，但模型中血清TG含量和肝功能水平下降，且由于缺少膽堿和蛋氨酸成分，不符合人類實(shí)際的飲食情況?，F(xiàn)有MCD誘導(dǎo)的肝脂變模型中動(dòng)物體重嚴(yán)重下降，試驗(yàn)期間體重下降約40%，該模型存在很大的缺陷[9-10]。人類生活中高脂飲食是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的主要因素，而使用的一些藥物或者攝入的毒性物質(zhì)也會(huì)損傷肝臟。目前對(duì)模型動(dòng)物的選擇、造模時(shí)間、高脂飼料的配比以及是否應(yīng)用輔助藥物干預(yù)等各不相同，但由于小鼠的自由攝食存在攝入量不可控問(wèn)題，影響模型成功率的缺陷?；谏锎蠓肿铀幬锏拈_(kāi)發(fā)和NAFLD發(fā)病率的增大，亟需建立解決上述模型問(wèn)題的動(dòng)物模型。該研究在小鼠飼養(yǎng)過(guò)程中灌胃腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液，模擬人群高脂高糖不良飲食習(xí)慣的生活方式，誘導(dǎo)與人類NAFLD的發(fā)生、發(fā)展接近的小鼠模型。通過(guò)基礎(chǔ)飼料聯(lián)合高脂腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)劑灌胃誘導(dǎo)，建立C57BL/6J小鼠NAFLD模型，旨在為該疾病模型的建立及疾病相關(guān)研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，40只，7～8周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20140007;試驗(yàn)鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK（魯）20180003;白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）ELISA試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TG和TC試劑盒，購(gòu)自日本協(xié)和醫(yī)藥診斷株式會(huì)社。蔗糖、豬油和雞蛋均購(gòu)自濱州全福元超市;膽固醇購(gòu)自江蘇源盛通生物工程有限公司;膽酸鈉購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;丙硫氧嘧啶購(gòu)自德國(guó)赫爾布蘭德制藥廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

顯微鏡，由日本歐林巴斯光學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn);SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)，由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn);DNM-9602型酶標(biāo)分析儀由北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn);高溫蒸汽壓力滅菌鍋由上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及造模方法。

試驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將試驗(yàn)小鼠按照隨機(jī)數(shù)字的方法分為正常組和模型組，每組20只。正常組灌胃PBS，模型組灌胃腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液（配方為10%蔗糖、10%豬油、3%雞蛋黃、2%膽固醇、1%膽酸鈉、0.5%丙硫氧嘧啶）。為減少灌胃對(duì)小鼠造成的應(yīng)激反應(yīng)，第1周按0.01 mL/g的劑量進(jìn)行灌胃，第2周灌胃劑量增加至0.02 mL/g，第3周恢復(fù)至正常灌胃劑量0.03 mL/g，持續(xù)灌胃16周，每天2次。于第10、12、14、16周分別處死3只小鼠，檢測(cè)是否達(dá)到NAFLD脂變程度。試驗(yàn)期間所有小鼠均自由采食和飲水。

1.3.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

在顯微鏡下觀察，肝組織脂肪變性程度30%以上的肝細(xì)胞脂肪變性者視為脂肪肝，75%以上的肝細(xì)胞脂肪變性者視為重度脂肪肝。判斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華肝病學(xué)會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》（2018年修訂版）。

1.3.3 標(biāo)品收集。造模開(kāi)始后，每周稱量體重。血液樣本采集：動(dòng)物禁食、不禁水12 h后，進(jìn)行眼球取血后頸椎脫臼法處死小鼠。分離到的血清采用生化分析儀進(jìn)行肝功能指標(biāo)和血脂的檢測(cè)，處死小鼠后稱重肝臟、脾臟和腹部脂肪，并用4%多聚甲醛固定，由武漢芭菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行病理學(xué)分析。

1.3.4 臟器系數(shù)。

完整取出肝臟和脾臟，用生理鹽水洗凈，用濾紙擦干后稱重，按以下公式計(jì)算肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)：肝臟系數(shù)（或脾臟系數(shù)）=肝濕重（或脾濕重）/末次體重×100%。

1.3.5 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。試驗(yàn)?zāi)┢?，小鼠禁食、不禁?2 h，用1%的戊巴比妥酸鈉腹腔注射麻醉，仰臥于動(dòng)物試驗(yàn)臺(tái)上，固定四肢并脫毛后暴露胸腹部，采用摘眼球方法采血。將采集的血液于4 ℃下靜置2 h后，3 000 r/min，離心15 min，吸取血清分裝在1.5 mL離心管內(nèi)，取部分血清使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、高密度脂蛋白（HDL-c）和低密度脂蛋白（LDL-c）的含量。

1.3.6 免疫因子檢測(cè)。

血清樣本中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的含量采用ELISA方法測(cè)定。

1.3.7 肝臟脂質(zhì)測(cè)定。

取肝臟左葉1 g，按1∶9勻漿介質(zhì)（生理鹽水）中，用電動(dòng)勻漿機(jī)4 ℃下制成10%勻漿，離心取上清液，采用二辛可寧酸法（BCA）檢測(cè)肝臟蛋白質(zhì)濃度。另外，稱取一塊100 mg的肝組織，置于900 μL的勻漿介質(zhì)氯仿/甲醇（體積比=2∶1）中，然后冰浴條件下進(jìn)行電動(dòng)勻漿，制成10%的組織勻漿;置于4 ℃下過(guò)夜，3 000 r/min離心15 min，取有機(jī)溶劑層，參考試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TG、TC含量;最后，根據(jù)肝臟蛋白濃度，計(jì)算肝脂水平。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著，P <0.01表示 差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃高脂高糖腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液對(duì)小鼠體重和臟器系數(shù)的影響 從圖1A可以看出，正常組和模型組小鼠體重在試驗(yàn)期間小鼠體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但隨著時(shí)間的變化，模型組小鼠體重從第2周開(kāi)始大于正常組。從圖1B可以看出，模型組小鼠肝臟系數(shù)大于正常組（ P <0.05），說(shuō)明模型組肝臟重量顯著增加;模型組脾臟系數(shù)大于正常組，但兩組間不存在顯著差異，說(shuō)明腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液灌胃可使肝臟重量顯著增加，但不會(huì)引起脾臟重量的顯著增加。

2.2 模型小鼠肝臟外觀和TG、TC含量 從外觀來(lái)看，正常組肝表面顏色普遍暗紅，色澤鮮亮，邊緣銳利，無(wú)油膩感;模型組肝臟顏色發(fā)黃，肝臟體積增大，包膜緊張，切面有油膩感（圖2A、B）。從圖2C、D可以看出，隨著灌胃時(shí)間的增加，模型組TG、TC含量均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，正常組TG、TC含量隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯;灌胃12周時(shí)模型組肝臟TC含量顯著高于正常組 （P <0.05），TG含量的增加不顯著;當(dāng)灌胃至14周時(shí)模型組TG、TC含量與正常組相比均顯著增加（ P <0.05）;灌胃至16周時(shí)，模型組TG、TC含量與正常組相比均顯著增加（ P <0.01）。這表明灌胃16周時(shí)模型組小鼠肝臟內(nèi)有大量的脂質(zhì)沉淀。

2.3 模型小鼠HE染色 從圖3A可以看出，正常組小鼠肝細(xì)胞在不同時(shí)間的肝組織中結(jié)構(gòu)完整清晰、肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射性分布，細(xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻，無(wú)脂滴;模型組小鼠肝臟隨著時(shí)間的延長(zhǎng)脂肪變性明顯，肝細(xì)胞腫大變圓，細(xì)胞質(zhì)疏且內(nèi)含大的脂肪滴（圖3A箭頭所示），肝細(xì)胞排序混亂，肝細(xì)胞脂肪嚴(yán)重。從圖3B可以看出，與正常組相比，模型組小鼠的脾臟細(xì)胞核均被不同程度破壞，且排列不規(guī)整，有一定程度的炎癥;脂肪細(xì)胞HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組脂肪細(xì)胞的體積較正常組明顯增大。

2.4 模型小鼠體內(nèi)炎癥水平 從表1可以看出，模型組小鼠血清TNF-α含量顯著高于正常組，說(shuō)明模型組小鼠肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng);模型組小鼠血清內(nèi)IL-6含量比正常組高3.48倍 （P <0.05），說(shuō)明高糖高脂膳食可引起血清中炎癥因子分泌增多，使小鼠體內(nèi)發(fā)生炎性病變。

2.5 模型小鼠血脂和肝功能水平 ?從表2可以看出，與正常組相比，模型組TC、TG含量顯著增加（ P <0.01），HDL-c含量有一定程度的降低，但差異不顯著，而LDL-c含量顯著增加（ P <0.05）;模型組血清中AST、ALT含量顯著高于正常組（ P <0.05），說(shuō)明模型組小鼠血脂含量升高并且肝臟功能受到一定程度的損傷，出現(xiàn)明顯的炎性病變。

3 結(jié)論與討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，而該疾病由于TG在肝臟內(nèi)的大量沉積引起一系列代謝應(yīng)激相關(guān)性肝病，給人類的健康帶來(lái)很大威脅，因此建立與人類自然發(fā)病規(guī)律相近的動(dòng)物模型迫在眉睫?，F(xiàn)有的采用高脂攝食喂養(yǎng)SD大鼠或膽堿-蛋氨酸缺乏（MCD）喂養(yǎng)C57BL/6J構(gòu)建NAFLD模型[11]。前者造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成試驗(yàn)資源的浪費(fèi);后者因?yàn)椴捎肕CD飼料，不符合正常飲食情況，雖然造模時(shí)間較快，但模型小鼠血清中TG和肝脂水平下降不符合病變情況[12]。劉鋒等[13]使用聯(lián)合化學(xué)藥物（四氯化碳）的方法，雖然提高了造模的成功率，但偏離了正常飲食。理想的動(dòng)物模型構(gòu)建方法應(yīng)具有模型重復(fù)性好、試驗(yàn)中動(dòng)物死亡率低、試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、構(gòu)建的疾病隨時(shí)間有發(fā)展過(guò)程等特點(diǎn)，才能使構(gòu)建出的模型與人類自然發(fā)病規(guī)律相接近。

該試驗(yàn)采用高脂高糖腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液灌胃C57BL/6J雄性小鼠16周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠體重上升，血脂、肝脂水平升高，血清中AST、ALT含量顯著提高，表明造模16周小鼠肝臟出現(xiàn)明顯脂肪積累、肝損傷和炎癥，是明顯的NAFLD特征。肝臟、脾臟和脂肪組織的病理學(xué)檢測(cè)表明，試驗(yàn)?zāi)┢谛∈蟾渭?xì)胞出現(xiàn)脂質(zhì)空泡（超過(guò)30%），形成典型的NAFLD病變，結(jié)合肝功能受損檢測(cè)結(jié)果，可判斷出肝細(xì)胞已出現(xiàn)明顯的炎癥壞死現(xiàn)象。該試驗(yàn)在自由攝食普通飼養(yǎng)喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上灌胃高糖高脂的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液以及一定量的膽酸鈉和丙硫氧嘧啶誘導(dǎo)動(dòng)物肝組織脂肪變、血脂異常和炎癥反應(yīng)的肝臟脂肪病變動(dòng)物模型，該方法建立的肝脂變模型穩(wěn)定性好，能形成中重度肝脂變特征，為更好地研發(fā)NAFLD以及新藥開(kāi)發(fā)，特別是大分子藥物的開(kāi)發(fā)提供了可靠的模型保證。

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