紅掌分蘗芽愈傷組織誘導與再生研究

劉良夢, 劉欣, 趙桃娟, 陳炙, 李佳蔓, 黃振

四川省林業(yè)科學研究院，森林和濕地生態(tài)恢復與保育四川重點實驗室，四川 成都 610081

紅掌（Anthurium andraeaum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物，又名花燭、安祖花、幸運花、紅苞芋等，紅掌原產(chǎn)于中南美洲熱帶雨林，紅掌株高50~80 cm，無莖，葉從根莖處抽出，葉被革質(zhì)，具長葉柄，單生，葉色深綠，長圓心形，有光澤，全緣，葉脈凹陷。進入成年期以后，花依循一葉一花形式生長，自葉腋抽出，高出葉片，肉質(zhì)佛焰狀花序直立于苞片中，形如燈臺，由于形態(tài)獨特，寓意深刻，是花卉市場的中高檔盆花的代表。

紅掌的自然繁殖方式可分為分蘗繁殖和種子繁殖，分蘗繁殖效率慢，種子繁殖變異大，此兩種方式均不能作為規(guī)模化繁育的首選[1]，隨著紅掌組織培養(yǎng)技術(shù)的攻克，紅掌組培苗已經(jīng)成為市場紅掌的主要來源。本研究以紅掌品種“特侖薩”的分蘗芽為材料，研究了激素類型和濃度對愈傷組織誘導、不定芽再生、幼苗生根的影響，為改良紅掌組培繁育技術(shù)提供新的試驗支撐。

1 材料和方法

1.1 材料來源

供試材料來源于成都市郫都區(qū)春天花樂園花卉市場的紅掌品種“特侖薩”成品盆花，規(guī)格為120 mm雙色盆，購買后的盆花放置在溫室大棚內(nèi)，常規(guī)養(yǎng)護管理，每7 d用500倍25%多菌靈溶液澆透一次。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌外植體制備。

待基部分株后，選擇長1~2 cm的分蘗芽，剪下后帶回實驗室，在含有洗潔精的清水中擦拭芽表面，流水下沖洗干凈后轉(zhuǎn)入超凈工作臺，把芽投入含有 75 mL 0.1% 升汞溶液的 150 mL 中消毒 8 min，期間不斷搖晃三角瓶；用無菌水沖洗分蘗芽5次，每次不少于2 min后備用。

外植體轉(zhuǎn)入不含有激素的基礎培養(yǎng)基：MS+30 g·L–1蔗糖；pH 5.8。觀察 7 d 后，淘汰掉污染的外植體，無菌外植體轉(zhuǎn)入下一步試驗。

1.2.2 愈傷組織誘導。

以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA和NAA分別為因素的兩因素四水平正交試驗，設計6-BA濃度為0.2 mg·L–1、 0.5 mg·L–1、 1.0 mg·L–1、 2.0 mg·L–1，NAA 濃度為 0.01 mg·L–1、0.02 mg·L–1、0.05 mg·L–1、0.1 mg·L–1的愈傷組織誘導培養(yǎng)基試驗。

每處理共接種30個外植體，分為3次重復，10個外植體/重復。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計外植體生長情況。

1.2.3 不定芽分化。

把愈傷組織從誘導培養(yǎng)基中取出，洗凈表面培養(yǎng)基后，切成0.5 cm大小后轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，6-BA和NAA分別為因素的兩因素四水平正交試驗，設計6-BA濃度為0.1 mg·L–1、0.2 mg·L–1、0.5 mg·L–1、1.0 mg·L–1，NAA濃度為0.02 mg·L–1、0.05 mg·L–1、0.1 mg·L–1、0.2 mg·L–1。

培養(yǎng)40 d后，從每處理中隨機取10個愈傷組織分化的芽叢，統(tǒng)計合格芽苗數(shù)量，合格芽苗判斷標準為：苗高≥1 cm，葉片數(shù)≥2，葉片寬≥1 cm，葉片厚實翠綠。

1.2.4 生根培養(yǎng)。

剪下合格芽苗后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。以1/2MS+20 g·L–1蔗糖+0.2 g·L–1AC 為基本培養(yǎng)基，6-BA 和IBA分別為因素的兩因素四水平正交試驗，設計6-BA 濃 度 為 0 mg·L–1、 0.01 mg·L–1、0.02 mg·L–1、0.05 mg·L–1，IBA 濃 度 為 0.1 mg·L–1、0.2 mg·L–1、0.5 mg·L–1、1.0 mg·L–1。

每處理共接種400株，分為4個重復，100株/重復。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計芽苗的生根情況，合格生根苗判斷標準為：苗高≥3 cm，氣生根數(shù)≥2，氣生根長≥1 cm，不定根數(shù)≥2，葉片數(shù)≥3，葉片厚實翠綠。

1.2.5 培養(yǎng)條件。

未做說明時，以上培養(yǎng)基均添加 7 g·L–1卡拉膠，蔗糖 30 g·L–1，pH 5.8，培養(yǎng)溫度 25±2 ℃，光照時長 12 h·d–1，光照強度為 2 000 Lx。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 DPS 16.05進行正交試驗方差分析和SNK多重比較，百分數(shù)反正弦轉(zhuǎn)換后再行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅掌愈傷組織誘導

紅掌分蘗芽接入愈傷誘導培養(yǎng)基后10 d，芽基部逐步膨大（見圖1A），20 d后基部可見淡黃色愈傷組織（見圖1B），或膨大基部愈傷化（見圖1C），不同處理的愈傷組織大小和質(zhì)地各不相同。方差分析結(jié)果表明，6-BA和NAA均對愈傷組織的大小有顯著影響（見表1）。

表1 紅掌愈傷組織誘導方差分析Tab.1 Variance analysis of callus induction of Anthurium andraeanum

進一步的多重比較結(jié)果見表2，從中可以發(fā)現(xiàn)，愈傷組織直徑從0.2~1.4 cm不等，整體來看，6-BA濃度對愈傷組織平均直徑的影響最大，濃度越高，愈傷組織平均直徑越大，當濃度為0.2 mg/L時，能發(fā)現(xiàn)外植體基部有少量愈傷形成，隨著6-BA濃度的增加，外植體逐漸經(jīng)歷基部長出大團愈傷、插入培養(yǎng)基部分膨大為愈傷而上部芽苗正常或枯萎、外植體整體愈傷化等階段。

表2 不同處理的紅掌愈傷組織平均直徑與愈傷狀態(tài)比較Tab.2 Comparison of average diameter and callus state of Anthurium andraeanum under different treatments

NAA濃度對愈傷組織平均直徑的影響相對要小，其作用更多的表現(xiàn)在愈傷的狀態(tài)上，NAA低濃度時，愈傷組織質(zhì)地軟，易變形（處理5、6、9、10、13、14），濃度升高，則愈傷組織容易碎，這種狀態(tài)非常不利于后續(xù)的繼代操作（見圖1E、F），故這些處理應該摒棄，有的處理，如處理4，則在愈傷和莖干上誘導出了不定根，沒有達到愈傷誘導和增殖的效果。

由于愈傷組織的篩選需要根據(jù)其分化能力來比較，即需要比較愈傷組織質(zhì)地、顏色等指標綜合考慮，一般0.5 cm以上的愈傷即可滿足后期分化的需求，從剩余處理中選愈傷組織呈淡黃色至綠色、質(zhì)地堅硬的、表面有細小顆粒狀突起的處理有：處理3、7、8、11、12，處理3愈傷較小，達不到后期誘導的需求，處理8、11、12誘導的愈傷大小和質(zhì)地合適，但處理8、12的愈傷會長不定根，處理7、11和12的部分外植體的頂芽會枯萎（見圖1C、D），但不影響后續(xù)的不定芽再生。結(jié)合下一步的試驗，發(fā)現(xiàn)6-BA濃度越高，不定芽再生數(shù)量越多而有效芽減少的現(xiàn)象，為減輕6-BA的積累效應，在愈傷組織誘導階段，應在保證愈傷組織誘導效果的同時，盡量選擇6-BA濃度低的處理。

圖1 紅掌愈傷組織誘導。A：接種10 d時的外植體，箭頭示新生的愈傷組織；B：處理3中幼芽和基部愈傷組織；C：處理7，頂芽枯萎掉落，箭頭示頂芽掉落后的莖段；D：處理11的綠色大愈傷組織，箭頭示原來頂芽位置；E：處理13的軟愈傷組織；F：處理15的外植體膨大形成的愈傷組織Fig.1 Callus induction of Anthurium andraeanum.A: Explants inoculated for 10 days, the arrow shows the newly callus; B: Bud and the base callus in treatment 3; C: Treatment 7, the apical bud wither and fall, the arrow shows the status of stem; D: Large green callus of treatment 11, the arrow indicates the position of the original apical bud; E: Soft callus of treatment 13; F: Callus formed by explant expansion of treatment 15

綜上所述，優(yōu)選處理7（0.5 mg·d–16-BA + 0.05 mg·d–1NAA）為誘導紅掌分蘗芽愈傷組織激素組合。

2.2 紅掌不定芽分化

紅掌愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基后10 d，愈傷組織表面可見顆粒狀突起，20 d后可見不定芽生成，不定芽高3~5 mm，呈圓柱狀，其上方有一片幼葉，待幼葉長至3 mm寬時，第二片葉開始萌發(fā)，30 d后長出2~4片葉子，苗高可達2~4 cm，部分芽苗莖段上可見氣生根，各處理的平均有效芽數(shù)/愈傷介于3.2~6.2個之間。方差分析結(jié)果表明，6-BA和NAA均對不定芽的分化效果有顯著影響（見表3）。

表3 紅掌不定芽分化方差分析Tab.3 Variance analysis of adventitious bud differentiation of Anthurium andraeanum

進一步多重比較結(jié)果見表4，從中可以發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的分化率不斷提高（見圖2A），而當提高至 1.0 mg·L–1時，平均有效芽數(shù)反而降低了，究其原因，并非誘導的不定芽數(shù)量少了，而是在整個愈傷的四周，布滿了密密麻麻的芽點，過于集中的芽點在長大的過程中相互擠壓，搶占養(yǎng)分，導致整體長勢差（見圖2C），而愈傷組織下部萌發(fā)的不定芽（見圖2B），甚至會把這個愈傷組織頂離培養(yǎng)基，更加加劇了愈傷組織上面不定芽的黃化或老化。

表4 不同處理的紅掌有效不定芽數(shù)量比較Tab.4 Comparison of the number of effective adventitious buds of Anthurium andraeanum under different treatments

而NAA在不定芽誘導階段的表現(xiàn)與愈傷誘導時的表現(xiàn)略有不同，NAA對堅硬的愈傷組織沒有軟化作用，但其誘導出根的能力依然存在。NAA濃度在0.1 mg·d–1以上時，愈傷組織會長出不定根，擠占了不定芽的空間，影響不定芽的分化；部分不定芽莖段上也會萌發(fā)出根，這些不定芽容易畸形或停止生長。

因此，在愈傷組織再生階段，并非不定芽越多越好，而是根據(jù)愈傷組織的大小，合理分布，以一個愈傷組織5~7個芽為宜（見圖2D、E），與牛瑞鶴等的研究結(jié)論一致[2]，既能保證新生不定芽均能長大為芽苗，也能繼續(xù)維持愈傷組織的狀態(tài)，在剪去芽苗后，愈傷組織還能繼續(xù)培養(yǎng)出不定芽，據(jù)測算，一個5 mm大小的愈傷組織，能連續(xù)培育8~10輪健壯芽苗。

綜上所述，從平衡考慮的角度出發(fā)，處理6（0.2 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA）為紅掌不定芽分化激素組合。

2.3 紅掌芽苗生根

紅掌芽苗轉(zhuǎn)入各個處理的生根培養(yǎng)基10 d后，芽苗基部可見有白色突起，表面根原基已經(jīng)形成，莖段上氣生根伸長，氣生根上可見白色根毛，20 d后，根原基發(fā)育成根，30 d時，跟在培養(yǎng)基內(nèi)盤旋1~2周，部分根變?yōu)榫G色（見圖2F）。方差分析結(jié)果表明，6-BA對芽苗生根影響顯著，而IBA對芽苗生根影響不顯著（見表5）。

表5 紅掌芽苗生根方差分析Tab.5 Variance analysis of shoot rooting of Anthurium andraeanum

圖2 紅掌愈傷組織再生。A-C：處理13的不定芽；D-E：處理6的不定芽；F：不定芽生根效果Fig.2 Callus induction of Anthurium andraeanum.A-C: Adventitious buds of treatment 13; D-E: Adventitious buds of treatment 6; F: Rooting effect of adventitious buds

多重比較結(jié)果見表6，從中可以看出，在不添加6-BA，僅有IBA時，紅掌生根狀態(tài)良好，有效苗比例均在85%以上，并且處理2和處理3中新生的氣生根較多。而在添加了6-BA以后，芽苗容易畸形，在低濃度的6-BA中（處理5-8），芽苗基部膨大，能長出不定根，但這種苗子在出圃后基部肥大，長勢沒有處理1-4培育的生根苗好，推測原因是基部膨大后，對芽苗內(nèi)部的輸導組織造成了傷害，影響到了大苗的發(fā)育。隨著6-BA濃度的增加（處理9-12），芽苗基部出現(xiàn)了愈傷組織，出現(xiàn)了類似于2.1中愈傷組織誘導時的現(xiàn)象，而此時愈傷組織是不需要的，當6-BA濃度繼續(xù)增加時，更會導致氣生根的畸形。

表6 不同處理的紅掌有效苗比率與幼苗狀態(tài)比較Tab.6 Comparison of the number of effective adventitious buds of Anthurium andraeanum under different treatments

綜上所述，在紅掌芽苗生根的階段，只添加0.2~0.5 mg/L IBA即可達到理想的生根效果。

將生根苗移至薄膜大棚中煉苗，光照控制在2500~5000 lx，溫度 20~30 ℃，7~10 d 后移栽，選用 0~10 mm細泥炭+1%珍珠巖。濕度保存70%以上，溫度30 ℃以下，15 d左右氣根開始生長。

3 結(jié)論與討論

本研究以紅掌“特侖薩”2—3 cm長的分蘗芽為外植體，在 MS+0.5 mg·L–16-BA + 0.05 mg·L–1NAA+ 30 g·L–1蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 30 d 后，能誘導出直徑0.5～1.0 cm、質(zhì)地堅硬的愈傷組織。愈傷組織在1/2MS+0.2 mg·L–16-BA+0.05 mg·L–1NAA+ 30 g·L–1蔗糖的培養(yǎng)基中40 d后，可平均分化6個有效芽，同時愈傷保持持續(xù)分化能力。芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS+0.2—0.5 mg·L–1IBA+20 g·L–1蔗糖的培養(yǎng)基 30 d 后，可發(fā)育為苗高3 cm以上、帶有不定根和氣生根的生根苗。

外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)能否成功的首要問題。外植體的分化程度與不定芽和芽苗的實際苗齡直接相關(guān)。紅掌外植體多采用葉片、葉柄、莖、根、苞片、花軸等，其中以葉、葉柄的報道居多[1-10]。盡管葉片取材和消毒均容易，但葉片外植體的缺陷是其分化程度較高，再生出來的芽苗實際年齡與母株一樣，如劉寶駿等利用“粉冠軍”“羅賓奴”“冠軍”三個品種的葉片和葉柄為外植體，誘導獲得了胚性愈傷組織，胚性愈傷組織集中在葉片基部與葉柄相連的位置，而其他部位的誘導效果較差，但愈傷組織誘導率和體胚分化率均不高[4]。原因是供試材料為連續(xù)繼代超過6年的安祖花組培苗，材料本身已高度馴化，再生能力低下，缺乏胚性細胞，限制了胚性愈傷組織的形成。

本研究選用的紅掌分蘗芽，為母株基部萌發(fā)，是所有外植體中最為幼化的材料[11]，其不足之處是單株產(chǎn)生的分蘗數(shù)量少且需要長時間規(guī)范化培養(yǎng)大量母株，同時，分蘗與基質(zhì)接觸，表面帶菌較多，王晶等利用腋芽為外植體，消毒后接種在含有抗生素的培養(yǎng)基中，有效抑制內(nèi)生菌的生長[5]，但長期培養(yǎng)有隱患。因此，本研究認為多準備母株、大棚標準管理，盡可能提供多的外植體是必要的。同時，本研究愈傷組織來源于分蘗芽莖段內(nèi)的分生組織，其分生能力天然強于葉肉、根等材料，與大部分紅掌愈傷組織形成需要 50~60 d 相比[2, 12]，本研究愈傷組織形成時間縮短一半。

激素配比則是愈傷組織誘導、分化和生根的核心所在[11, 14]。紅掌愈傷組織的誘導，2，4-D、NAA等分裂素與6-BA聯(lián)合使用的效果好，其中2,4-D誘導愈傷組織最快并且量大，在葉片、葉柄愈傷組織的誘導中運用廣泛[12, 2, 14]。但 2,4-D 誘導分蘗芽時，愈傷質(zhì)地松軟，后期愈傷組織器官發(fā)生效果差，適宜于誘導胚性愈傷組織[15]。體胚發(fā)育中容易出現(xiàn)胚狀體的根與芽發(fā)育不均衡導致植物形態(tài)建成失敗[4]。因此，本研究未使用2,4-D，而采用6-BA和NAA的組合誘導愈傷，研究發(fā)現(xiàn)，隨BA濃度的增大，質(zhì)地逐漸變緊密、堅硬。隨NAA濃度的增加愈傷組織趨于疏松，這與關(guān)婧竹[9]對于BA和NAA濃度對愈傷質(zhì)地的變化趨勢是一致的。

由于紅掌品種繁多，沒有一種配方能滿足所有品種的需求，需要根據(jù)外植體在培養(yǎng)基中的表現(xiàn)，調(diào)整配方，以使外植體向目標方向發(fā)育。付娜對三種紅掌的再生進行了研究，6-BA最佳濃度從0.2～1.0 mg/L不等，濃度差5倍[3]。培養(yǎng)基中其他成分也對紅掌組培有重要作用，辛偉杰采用蔗糖和葡萄糖混搭的方法，誘導出了體胚[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中氮含量、活性炭含量均能影響不定芽分化或不定芽的生長（篇幅所限沒有進行分析）。

本研究建立了紅掌“特侖薩”的分蘗芽誘導愈傷組織和再生技術(shù)體系，為下一步利用愈傷組織開展遺傳轉(zhuǎn)化體系研究奠定了材料基礎[17, 18]。