青蒿琥酯對(duì)人Tenon囊成纖維細(xì)胞自噬的影響

陳靜 羅高權(quán) 陳藝

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科（廣州510150）；2中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州510010）

青光眼是一種不可逆的致盲性眼病，其致盲率僅次于白內(nèi)障［1］，目前醫(yī)治青光眼最常用的手術(shù)方案仍是濾過(guò)性手術(shù)，但術(shù)后濾過(guò)通道的瘢痕化是導(dǎo)致手術(shù)失敗的重要原因。根據(jù)報(bào)道青光眼濾過(guò)性手術(shù)最常用的小梁切除術(shù)5年內(nèi)手術(shù)失敗率高達(dá)30%［2］。目前，抗代謝藥如絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），仍是臨床上最常用的抗術(shù)后濾過(guò)通道瘢痕化的藥物。雖然MMC 和5-FU 有一定療效，但它們所導(dǎo)致的角膜和結(jié)膜上皮損害、前房延遲形成、脈絡(luò)膜損傷、濾過(guò)泡滲漏、術(shù)后感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)及并發(fā)癥不容忽視。因此尋找安全有效的抗青光眼術(shù)后濾過(guò)通道瘢痕化的新藥，一直是青光眼醫(yī)師的研究熱點(diǎn)。青蒿琥酯（artesunate，Art）是青蒿素的衍生物，隨著對(duì)青蒿素及其衍生物研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其除傳統(tǒng)的抗瘧作用外，還具有抗瘢痕等作用［3］。本課題組前期研究證實(shí)，Art 能抑制體外培養(yǎng)的人Tenon 囊成纖維細(xì)胞（human tenon′s capsule fibroblasts，HTFs）的增生，誘導(dǎo)其凋亡［4］。自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并通過(guò)溶酶體降解的過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的代謝需要和細(xì)胞器的更新，機(jī)體的生理和病理過(guò)程中都存在自噬。自噬可通過(guò)清除受損的細(xì)胞器對(duì)細(xì)胞存活起保護(hù)作用，而過(guò)度自噬將導(dǎo)致細(xì)胞程序性凋亡［5］，因此，自噬所起的作用是正面還是負(fù)面尚待研究。研究證實(shí)在淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌中，Art可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［6-8］。本研究通過(guò)觀察不同濃度Art 處理HTFs，利用分子生物學(xué)手段探討Art 對(duì)HTFs 自噬的影響，從而為其在青光眼濾過(guò)性手術(shù)中的應(yīng)用提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 HTFs 購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。Art（中國(guó)桂林南藥股份公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclon 公司）；胰蛋白酶、二甲亞砜（美國(guó)Sigma 公司）；噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒（中國(guó)南京凱基生物有限公司）；ECL 顯色試劑盒（美國(guó)Thermo 公司）；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑（中國(guó)北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（quantitative reverse transcriptase PCR，qRT-PCR）檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ABI 公司）；兔抗人Beclin-1 抗體、β-actin 鼠抗人單克隆抗體、小鼠抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）-Ⅱ抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔及抗鼠IgG 二抗（中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所）；Cyto-ID?Green 自噬檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Enzo Life Sciences 公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國(guó)Invitrogen 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HTFs 細(xì)胞，置于5%二氧化碳37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。及時(shí)換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)基底的80% 時(shí)給予0.25%胰酶消化細(xì)胞傳代處理。取3 ～6 代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT 法檢測(cè)HTFs 增殖 消化計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTFs 細(xì)胞，接種于96 孔板，置于5%二氧化碳37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、Art 實(shí)驗(yàn)組（50，100，150，200 μg/mL）。空白對(duì)照組和Art 實(shí)驗(yàn)組HTFs 細(xì)胞分別加入到含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，Art 實(shí)驗(yàn)組按規(guī)定加入不同濃度（50，100，150，200 μg/mL）Art。再分別設(shè)置（24 和48 h）不同時(shí)間組。每組均鋪3 復(fù)孔，置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)觀察量效和時(shí)效關(guān)系。每孔加入5 g/L 的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔于570 nm 波長(zhǎng)下吸光度（A）值，取5 次測(cè)量的平均值。計(jì)算Art 對(duì)HTFs 的抑制率。生長(zhǎng)抑制率=（1-處理組A/對(duì)照組A）×100%。

1.4 qRT-PCR 法檢測(cè)HTFs 中LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表達(dá) 分組方法同上。加藥48 h 后，PBS 緩沖液輕輕沖洗，反復(fù)兩至三次，1 mL Trizol 輕輕吹打細(xì)胞，收集液體。根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。紫外分光光度儀測(cè)量RNA 濃度及純度。按照qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：42 ℃，60 min，70 ℃，5 min，4 ℃靜置。β-actin為內(nèi)參對(duì)照。引物序列設(shè)計(jì)：β-actin 上游引物：CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC；下游引物：TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT。LC3-Ⅱ上游引物：GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG；下游引物：ACTCTCATACACCTCTGAGATTG。Beclin-1 上游引物：TGGATCACCCACTCTGTGAG；下游引物：TTATTGGCCAGAGCATGGAG。進(jìn)行各組mRNA 的相對(duì)表達(dá)量的分析。

1.5 Western blot法檢測(cè)HTFs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá) 空白對(duì)照組和Art 實(shí)驗(yàn)組處理方法同上。處理48 h 后，收集各組細(xì)胞，置冰上裂解并提取總蛋白，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS 分離膠，取等量的上樣蛋白加入SDS 凝膠中，電泳跑膠，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，待脫脂奶粉液封閉漂洗后，加入相應(yīng)一抗（小鼠抗人LC3-Ⅱ抗體、兔抗人Beclin-1 抗體，β-actin 鼠抗人單克隆抗體），4 ℃孵育過(guò)夜，次日漂洗后用山羊抗兔及抗鼠辣根過(guò)氧化物抗體37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImagJ 軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參，進(jìn)行目的蛋白的相對(duì)含量分析。

1.6 Cyto-ID 染色法鑒定HTFs 自噬水平 選用150 μg/mL Art 處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組不加Art。實(shí)驗(yàn)組加入150 μg/mL Art 后，兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用緩沖液漂洗2 次，加入適量染色試劑（自噬體染色劑Cyto-ID 與細(xì)胞核染色劑DAPI），置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，棄多余的染料，用緩沖液清洗細(xì)胞3 次，在熒光顯微鏡下觀察，Cyto-ID 染色陽(yáng)性細(xì)胞即自噬細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，綠色熒光為核周圍和細(xì)胞質(zhì)的自噬小體及自噬溶酶體。隨機(jī)選取200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Cyto-ID染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以Cyto-ID染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比來(lái)表示HTFs的自噬水平，重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Art 對(duì)HTFs 增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24 h 和48 h 后，Art 實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖均受到抑制，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。作用時(shí)間相同（24、48 h），隨著Art 濃度增高，抑制率分別由4.7%增至59.1%，由13.3%增至68.6%。 Art 濃度相同（50，100，150，200 μg/mL），隨作用時(shí)間增加，抑制率分別由4.7%增至13.3%，由8.7%增至31.4%，由36.2%增至50.0%，由59.1%增至68.6%。見表1。隨著Art 濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，Art 對(duì)細(xì)胞抑制作用越明顯，表現(xiàn)為濃度-效應(yīng)及時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。

表1 Art 對(duì)HTFs 的細(xì)胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

表1 Art 對(duì)HTFs 的細(xì)胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

分組空白對(duì)照組Art 實(shí)驗(yàn)組（μg/mL）50 100 150 200 24 h A 值0.127±0.002 0.121±0.004a 0.116±0.002b 0.081±0.003b 0.052±0.001b抑制率（%）－4.7±0.4 8.7±0.9 36.2±1.2 59.1±1.3 48 h A 值0.188±0.005 0.163±0.003b 0.129±0.002b 0.094±0.004b 0.059±0.002b抑制率（%）－13.3±0.6 31.4±1.1 50.0±1.0 68.6±1.3

2.2 不同濃度Art 對(duì)HTFs LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表達(dá)的影響 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：50、100、150、200 μg/mL Art 實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組均有明顯升高，不同濃度Art 實(shí)驗(yàn)組LC3-ⅡmRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別是空白對(duì)照組的（1.367±0.214）、（1.950±0.116）、（3.120±0.521）、（4.765 ± 0.371）倍；Beclin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別是空白對(duì)照組的（1.235 ± 0.164）、（1.746 ± 0.320）、（2.854 ± 0.244）、（3.487 ± 0.356）倍。各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FL= 20.920，P＜0.01；FB= 26.370，P＜0.01）?？傮w上隨著Art濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯提高，呈現(xiàn)濃度依賴的關(guān)系，見圖1。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)空白對(duì)照組與Art 實(shí)驗(yàn)組HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 LC3-Ⅱand beclin-l mRNA relative expression in control group and Art groups by qRT-PCR

2.3 不同濃度Art 對(duì)HTFs LC3-II 和Beclin-1 蛋白表達(dá)的影響 Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：50、100、150、200 μg/mL Art 組LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白表達(dá)量較空白對(duì)照組均有明顯升高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FL= 32.852，P＜0.01；FB= 29.874，P＜0.01）。總體上隨Art 濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白的表達(dá)量均明顯提高，呈現(xiàn)濃度依賴的關(guān)系。見圖2 及表2。

表2 Western blot 檢測(cè)HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

表2 Western blot 檢測(cè)HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

注：與空白對(duì)照組比較，aP ＜0.01

分組空白對(duì)照組Art 實(shí)驗(yàn)組（μg/mL）50 100 150 200 LC3-II 0.101±0.025 0.186±0.021a 0.302±0.082a 0.462±0.070a 0.808±0.102a Beclin-1 0.098±0.036 0.236±0.049a 0.441±0.101a 0.588±0.090a 0.784±0.064a

圖2 空白對(duì)照組與Art 實(shí)驗(yàn)組HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達(dá)Fig.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups

2.4 Art 作用后HTFs 自噬水平的變化 選用150 μg/mL Art 處理的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，不加Art 的細(xì)胞作為空白對(duì)照組。Cyto-ID染色結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組HTFs 的核周和細(xì)胞質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)的綠色熒光較空白對(duì)照組明顯濃聚，見圖3。對(duì)照組和150 μg/mL Art 實(shí)驗(yàn)組的Cyto-ID 染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為（13.302±2.301）%和（53.274±7.851）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.804，P＜0.01）。

圖3 熒光顯微鏡下觀察HTFs 經(jīng)Art 作用后自噬情況（×200）Fig.3 The autophagy activity of HTFs was evaluated by fluorescence microscope（×200）

3 討論

細(xì)胞自噬是真核生物界一種普遍存在的生命現(xiàn)象，它具有重要的生理意義。正常情況下，自噬充當(dāng)了垃圾處理和回收系統(tǒng)的功能，功能失常的自噬，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。研究顯示，自噬參與了多種細(xì)胞功能的調(diào)控，并與癌癥、衰老、創(chuàng)傷等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-11］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)自噬在抑制心肌、肺、腎臟等器官纖維化及疤痕的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［12-14］。研究證實(shí)肺纖維化以成纖維細(xì)胞過(guò)度增生、膠原蛋白過(guò)度沉積為特點(diǎn)，細(xì)胞自噬活化可以促進(jìn)膠原的降解，抑制膠原的大量堆積［12］。KIM 等［14］研究表明誘導(dǎo)自噬能明顯降低Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，降低腎纖維化。自噬與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展亦密不可分［15］。有研究發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細(xì)胞受腎上腺素刺激繼發(fā)細(xì)胞自噬，該反應(yīng)可能減少病理?xiàng)l件下高腎上腺素對(duì)心臟成纖維細(xì)胞造成的有害影響如心肌纖維化［14］。增生性疤痕的發(fā)生可能與自噬不足有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)在增生性疤痕組織自噬表達(dá)水平較正常組織明顯降低［16］。有報(bào)道提示，自噬是傷口愈合過(guò)程中重要的“參與者”，可能參與了病理性瘢痕纖維過(guò)度增殖與膠原無(wú)序沉積的病理生理過(guò)程。成纖維細(xì)胞的自噬在傷口愈合過(guò)程中起一定的調(diào)節(jié)作用，能夠減少細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的沉積，還可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β和將“異?！奔?xì)胞外基質(zhì)排出細(xì)胞，減少瘢痕的產(chǎn)生［17-20］。以上研究為進(jìn)一步探討自噬與抗青光眼術(shù)后濾過(guò)通道瘢痕化的關(guān)系提供了有益的啟示。前期研究證實(shí)，Art 能抑制HTFs 的增生，誘導(dǎo)其凋亡［4］，因此Art 在誘導(dǎo)HTFs 凋亡的同時(shí)，很可能對(duì)另一種細(xì)胞程序性死亡方式（自噬）也產(chǎn)生一定的影響。

LC3 是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物，與酵母蛋白Atg8具有較高的相似性。LC3 具有2 種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ存在一個(gè)生成-降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程。LC3 被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4 在羧基端剪切，生成胞質(zhì)LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ通過(guò)Atg7和Atg3 參與的泛素樣反應(yīng)，與自噬體雙層膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。在降解過(guò)程中，位于外膜的LC3-Ⅱ被半胱氨酸蛋白酶Atg4B 移除后回收，位于內(nèi)膜的LC3-Ⅱ則被溶酶體降解。由于LC3-Ⅱ存在于自噬體膜上，其表達(dá)量與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)。所以LC3-Ⅱ的表達(dá)量，可以作為一項(xiàng)衡量細(xì)胞內(nèi)自噬活性的一個(gè)客觀指標(biāo)［21］。Beclin-1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因。Beclin-1 與自噬前體的結(jié)合啟動(dòng)自噬體的形成。Beclin-1 也是自噬的正調(diào)控因子，其表達(dá)水平與自噬體的形成密切相關(guān)［22］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin-1 的mRNA 和蛋白的表達(dá)來(lái)觀察Art 對(duì)HTFs 自噬的影響。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT 法檢測(cè)不同濃度Art 作用24及48 h 對(duì)HTFs 的增殖抑制率，結(jié)果顯示，Art 濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)HTFs 增殖的抑制作用越明顯，呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系，其抑制率由4.7%增至68.6%。本研究應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot 檢測(cè)LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的相對(duì)表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Art作用48 h后，隨著Art 濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯提高。Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：Art 作用48 h 后，隨著Art 濃度的增加，LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白的表達(dá)量較空白對(duì)照組亦明顯提高。本實(shí)驗(yàn)表明Art 可以增加HTFs LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的表達(dá)，并且均具有濃度-效應(yīng)依賴性，證實(shí)Art 可誘導(dǎo)HTFs 發(fā)生自噬。

綜上所述，Art 可明顯上調(diào)HTFs 自噬水平，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，抑制HTFs 增殖。關(guān)于自噬的激活和Art 抑制HTFs 的增生效應(yīng)之間的關(guān)系及機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究，而在Art 處理后，凋亡與自噬在誘導(dǎo)HTFs 死亡過(guò)程中的相互作用方式尚需進(jìn)一步研究。自噬性細(xì)胞死亡是Art 對(duì)HTFs增殖抑制的重要機(jī)制之一，為研究Art 的作用機(jī)制及Art 在臨床上應(yīng)用于抑制抗青光眼術(shù)后濾過(guò)通道瘢痕形成提供了新的思路。