中藥的動物發(fā)育毒性系統(tǒng)評價*

謝小芳，王 軼，李文武，秦 博，路文柯，周 迷，楊 勇，△

（1. 四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，四川 內(nèi)江 641000； 2. 四川省人民醫(yī)院個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072； 3. 四川省資陽市人民醫(yī)院藥學部，四川 資陽 641300； 4. 四川省婦幼保健院藥學部，四川 成都 610045）

中藥用于臨床已有數(shù)千年歷史，但近年來中藥不良反應事件報道增多，中藥毒性受到廣泛關(guān)注。妊娠期是胚胎或胎兒在母體內(nèi)發(fā)育的特殊生理時期，妊娠期安全用藥是優(yōu)孕優(yōu)生的重要一環(huán)[1]。目前，我國孕期中藥及中成藥的用藥比例為52.38%，中藥已成為我國妊娠期婦女常用藥物[2]。古代醫(yī)家通過臨床經(jīng)驗已總結(jié)出妊娠期禁用中藥，但有一定局限性[3]。發(fā)育毒性是中藥臨床前毒性研究的重要組成部分，其主要研究父親或母親接觸外源理化物質(zhì)引起子代在到達成年前出現(xiàn)的胚胎畸形、器官功能障礙、生長遲緩，甚至胚胎死亡[4]。發(fā)育毒性研究方法包括體內(nèi)動物實驗和體外替代實驗[5－6]。人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)將體內(nèi)發(fā)育毒性實驗分為生育力與早期胚胎毒性（Ⅰ段生殖毒性）實驗、胚胎－胎仔毒性（Ⅱ段生殖毒性）實驗和出生前后毒性（Ⅲ段生殖毒性）實驗[7]。體內(nèi)發(fā)育毒性能對雌性和雄性生殖系統(tǒng)、母體受胎能力、胚胎發(fā)育的潛在不良影響進行評價，且能更好地模擬藥物在妊娠狀態(tài)下對母體和胎兒的影響，故在一定程度上能預測藥物對妊娠結(jié)局的影響。本研究中收集相關(guān)文獻，利用循證醫(yī)學方法對中藥的動物發(fā)育毒性進行系統(tǒng)評價，為科研工作的開展和臨床指導妊娠期合理使用中藥提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

利用計算機檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫、PubMed、Embase、TOXENT 數(shù)據(jù)庫自建庫起至2019 年12 月31 日的文獻。中文檢索詞為“中藥”“中藥單體”“中藥提取物”“中成藥”“發(fā)育毒性”“胚胎毒性”“生殖毒性”“致畸”；英文檢索詞為“traditional Chinese medicine”“Chinese traditional medicine”“Chinese herb”“Chinese herbal extract”“Chinese herbal compound”“reproductive toxicity”“developmental toxicity”“embryotoxicity”“teratogenicity”“teratogenesis”。并對重要參考文獻題錄進行人工補充檢索。

1.2 文獻納入標準與排除標準

納入標準：中藥發(fā)育毒性動物實驗；隨機對照研究；語言限定為中文和英文；研究動物為成年健康成熟未生育的大鼠、小鼠或家兔，每組不同性別鼠均不少于15 只、家兔均不少于12 只，不限動物種屬及亞種；實驗組為中藥組，包括中藥飲片、中藥提取物、中藥單體或中藥制劑，對照組為蒸餾水或溶劑對照；給藥時間為交配前2 ～4 周到交配期（雄性動物），交配期直至胚胎著床前（雌性動物）（Ⅰ期生殖毒性實驗）、胚胎著床開始到硬腭閉合結(jié)束（Ⅱ期生殖毒性實驗）和胚胎硬腭閉合至哺乳結(jié)束（Ⅲ期生殖毒性實驗）3 個時段，不限定給藥方式和給藥劑量；結(jié)局指標：主要結(jié)局指標為受孕率、平均活胎數(shù)、窩均胎仔體質(zhì)量、窩均胎仔體長、母體妊娠期體質(zhì)量增加量，次要結(jié)局指標為胎仔外觀、內(nèi)臟和骨骼的畸形情況。

排除標準：重復和實驗數(shù)據(jù)重復發(fā)表的文獻；文體類型為綜述、藥物機制、科普、專家述評、會議摘要等。

1.3 文獻篩選

采用Noteexpress 軟件對檢索出的文獻題錄進行對比并剔重，2 名研究員通過初步閱讀文題和摘要，排除不相關(guān)及文獻類型不符的文獻。再通過仔細閱讀全文，根據(jù)納入與排除標準確定最終納入文獻，并進行交叉核對，如遇分歧，則進行討論協(xié)商或由第三方裁定。

1.4 文獻提取

由2 名研究者根據(jù)已設計好的Excel 表格獨立進行文獻信息提取。提取資料：文獻基本信息，文題、第一作者、發(fā)表時間；研究對象特征，動物品系、體質(zhì)量、雌性與雄性動物交配比例、受孕動物數(shù)；干預措施，干預措施名稱、干預措施劑量、干預時間；結(jié)局指標，名稱、數(shù)量及結(jié)果。

1.5 納入研究的偏倚風險評估

由2 名研究者采用SYRCLE 動物實驗偏倚風險評估工具對納入文獻進行獨立評價[8]，對評價結(jié)果進行交叉核對，如遇分歧，則進行討論或由第三方解決，偏倚風險評價結(jié)果以“√”“×”“？”分別代表低、高和不確定。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用Cochrane 協(xié)作網(wǎng)提供的RevMan 5.3 統(tǒng)計軟件進行Meta 分析。連續(xù)型變量資料以加權(quán)均數(shù)差（WMD）及其95%置信區(qū)間(95% CI)表示；二分類變量以相對危險度（RR）及其95% CI 表示；納入研究間的異質(zhì)性行χ2檢驗，若異質(zhì)性檢驗結(jié)果為P ＞0.1，且I2≤50%，則采用固定效應模型分析；若I2＞50%，則采用隨機效應模型分析，若異質(zhì)性過大或結(jié)局指標難統(tǒng)計，則采用描述性分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索及篩選結(jié)果

通過計算機共檢索到文獻833 篇，手工補充檢索到81 篇。通過閱讀文題和摘要初步排除不相關(guān)和文題類型不符的文獻，獲得并閱讀全文文獻189 篇，依據(jù)納入標準，最終納入文獻29 篇[9－37]。

2.2 納入研究的基本特征

共納入29 篇文獻35 組研究數(shù)據(jù)，研究發(fā)表年份為2003 年至2019 年，中位發(fā)表時間為2012 年。納入研究中包括5 組Ⅰ段生殖毒性實驗，28 組Ⅱ段生殖毒性實驗及2 組Ⅲ段生殖毒性實驗。干預藥物包括中藥飲片（鹽附子、雄黃、朱砂、虎乳靈芝），中藥提取物（黃芩提取物、連翹提取物、千里光提取物、續(xù)斷水煎液），中藥單體（漢黃芩素、環(huán)維黃楊星D、千里光總堿、黃芪甲苷、甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯），中藥制劑（紅花如意丸、壽胎丸、滋腎養(yǎng)胎丸、婦科千金膠囊、坤泰膠囊、疏風解毒膠囊、云南白藥、復方千里光片、生血寧片、產(chǎn)虛屏顆粒、參麥注射液、牛蒡子注射液），其中妊娠期禁用中藥包括朱砂、雄黃、云南白藥、婦科千金膠囊、參麥注射液。動物種屬包括SD 大鼠、Wistar 大鼠、KM 小鼠、新西蘭白兔和普通家兔（見表1）。本研究中均采用中藥高劑量組與陰性對照組的發(fā)育毒性進行分析。

表1 納入文獻基本資料Tab.1 Basic data of included studies

2.3 納入研究偏倚風險評估

29 篇文獻中，對于分配序列的產(chǎn)生或應用，1 篇由計算機分配，3 篇由隨機化數(shù)字表分配，12 篇文獻按動物體質(zhì)量進行交替分配，6 篇按受孕順序進行交替分配，余未描述具體分配方式。動物基線從動物年齡和體質(zhì)量考慮，24 篇文獻的各組動物基線基本相同，且有27篇不同實驗組的動物飼養(yǎng)條件相同，但納入文章的分配隱藏方式不正確或不充分。29 篇文獻均納入全部研究動物進行結(jié)果評價，且對照組和實驗組使用相同的結(jié)果評價方法，但均未描述是否對研究者采取盲法。此外，3 篇未充分報告不完整的數(shù)據(jù)，6 篇具有選擇性結(jié)果高偏倚風險。詳見表2 和圖1。

圖1 納入研究偏倚風險評估Fig.1 Bias risk assessment of included studies

表2 納入研究偏倚風險評價結(jié)果Tab.2 Bias risk assessment of included studies

2.4 Meta 分析

妊娠結(jié)局：15 組研究報道了動物的受孕率，中藥組受精動物364 例，對照組受精動物359 例，各研究間無異質(zhì)性（P ＝0.81，I2＝0），采用固定效應模型分析。分析結(jié)果顯示，中藥組和對照組受孕率的合并效應量與無效線相交，因此兩組動物受孕率無顯著差異[ RR ＝0.98，95% CI（0.92，1.06），P ＝0.64]。此外，妊娠期非禁用中藥和妊娠期禁用中藥的受孕率均與陰性對照組無顯著差異（P ＞0.05）。詳見圖2。20 組研究報道了妊娠動物生產(chǎn)的平均活胎數(shù)，中藥組受孕動物383 例，對照組受孕動物386 例，各研究間存在中度異質(zhì)性（P ＜0.01，I2＝49%），采用固定效應模型分析。分析結(jié)果顯示，中藥組平均活胎數(shù)顯著少于對照組[MD ＝－0.60，95% CI（－1.00，－0.20），P ＝0.03]。亞組分析結(jié)果顯示，妊娠期非禁用中藥的平均活胎數(shù)顯著少于對照組（MD ＝－1.00，P ＜0.000 1）。妊娠期禁用中藥的平均活胎數(shù)和對照組無顯著差異。詳見圖3。

圖2 兩組動物受孕率Meta 分析森林圖Fig.2 Forest plot of Meta－analysis：Comparison of conception rate between the two groups

圖3 兩組動物活胎數(shù)Meta 分析森林圖Fig.3 Forest plot of Meta－analysis：Comparison of live births between the two groups

出生胎仔的體質(zhì)量和體長：18 組研究報道了出生胎仔的窩均體質(zhì)量，納入中藥組的受孕動物330 例，對照組受孕動物410 例，各研究間無異質(zhì)性（P ＝0.57，I2＝0），采用固定效應模型分析。分析結(jié)果顯示，中藥組的窩均胎仔體質(zhì)量與對照組無顯著差異[ MD ＝－0.01，95% CI（－0.08，0.05），P ＝0.68]。亞組分析結(jié)果顯示，妊娠期非禁用中藥和妊娠期禁用中藥與對照組的窩均胎仔體質(zhì)量無顯著差異（P ＞0.05）。詳見圖4。21 組研究報道了出生胎仔的窩均胎仔體長，納入中藥組的受孕動物380 例，對照組受孕動物394 例，各研究間無異質(zhì)性（P ＝0.50，I2＝0），采用固定效應模型分析。結(jié)果顯示，中藥組的窩均胎仔體長與對照組無顯著差異[ MD ＝－0.04，95% CI（－0.24，0.16），P ＝0.68]。亞組分析結(jié)果顯示，妊娠期非禁用中藥和妊娠期禁用中藥的窩均胎仔體長無顯著差異（P ＞0.05）。詳見圖5。

圖4 兩組動物窩均胎仔體質(zhì)量Meta 分析森林圖Fig.4 Forest plot of Meta－analysis：Comparison of average fetal body weight between the two groups

圖5 兩組動物窩均胎仔體長Meta 分析森林圖Fig.5 Forest plot of Meta－analysis：Comparison of average fetal body length between the two groups

母體妊娠期體質(zhì)量：16 組研究報道了SD 孕鼠的妊娠期體質(zhì)量增加量（G0－G20），中藥組的受孕鼠309 例，對照組受孕鼠308 例，各研究間存在重度異質(zhì)性（P ＜0.01，I2＝70%），采用隨機效應模型分析。分析結(jié)果顯示，中藥組孕鼠的體質(zhì)量增加量顯著低于對照組[ MD ＝－12.89，95% CI（－21.03，－4.75），P ＝0.02]。亞組分析結(jié)果顯示，妊娠期非禁用中藥組的孕鼠體質(zhì)量增加量顯著少于對照組[MD ＝－13.29，95% CI（－22.05，－4.52），P ＝0.03]，而妊娠期禁用中藥的母體妊娠期體質(zhì)量增加量與對照組無顯著差異[ MD ＝－10.62，95% CI（－41.19，－19.95），P ＝0.50]。詳見圖6。

圖6 兩組動物妊娠期體質(zhì)量增加量Meta 分析森林圖Fig.6 Forest plot of Meta－analysis：Comparison of the weight gain during pregnancy between the two groups

2.5 定性分析

5 篇文獻報道了生育力與早期胚胎毒性實驗。周莉等[31]研究發(fā)現(xiàn)，大劑量（15 g／kg）的藏紅花如意丸可延長大鼠的成功交配時間和動情間期，且可升高動物體內(nèi)黃體生成素和睪酮水平，降低雌二醇和孕酮水平。谷穎敏等[15]對朱砂進行Ⅰ段生育毒性實驗發(fā)現(xiàn)，大劑量的朱砂可使雄性睪丸、前列腺和精囊質(zhì)量減輕，臟器系數(shù)減小，且呈一定的量效關(guān)系，同時高劑量組動物子宮連胎兒質(zhì)量和子宮質(zhì)量顯著低于陰性對照組。長期給予大劑量的朱砂可抑制造血功能和誘導肝功能損傷。周國亮等[23]的研究表明，高劑量的云南白藥也可使雄性大鼠的睪丸、附睪、前列腺的質(zhì)量降低。李詠梅等[17]的研究表明，給予雄性和雌性大鼠大劑量的雄黃可增加其肝臟和腎臟的質(zhì)量及升高臟器系數(shù)，也可使雌大鼠出現(xiàn)肝細胞微空泡化、肝細胞脂肪變性，腎間質(zhì)灶性成纖維細胞增生伴淋巴細胞浸潤等病理損傷。

26 組胚胎－胎兒發(fā)育毒性實驗均對中藥組和對照組出生胎仔的外觀、內(nèi)臟和骨骼畸形進行了報道。由于不同實驗組觀察的胚胎畸形差異性較大，發(fā)生率較低，本研究中總結(jié)了中藥組和陰性對照出生胎仔的外觀畸形、內(nèi)臟畸形、骨骼畸形。詳見表3 至表5。

表3 兩組動物出生胎仔的外觀畸形（對照組／中藥組，例）Tab.3 The appearance deformities of animal fetus between the two groups（control group／TCM group,case）

表4 兩組動物出生胎仔的內(nèi)臟畸形（對照組／中藥組，例）Tab.4 The visceral deformities of animal fetus between the two groups（control group／TCM group,case）

表5 兩組動物出生胎仔的骨骼畸形（對照組／中藥組，例）Tab.5 The skeletal deformities of animal fetus between the two groups（control group／TCM group,case）

2 篇文獻報道了圍生期的發(fā)育毒性。吳瑜等[37]在雌性小鼠妊娠第15 天至分娩后第21 天給予生血寧后，發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠的產(chǎn)仔率稍低，但與對照組相比無顯著差異，且生理發(fā)育指標、神經(jīng)反射功能、行為活動及生育能力與對照組相比無顯著差異。潘淑賢等[36]進行產(chǎn)虛屏顆粒的圍產(chǎn)期毒性研究表明，各劑量組母體的生育力、胚胎發(fā)育和子代的生長發(fā)育、運動行為、學習記憶和生育能力與陰性對照組相比無顯著差異。

3 討論

中藥組成成分較多，作用機制較復雜，成分間相互作用也難以預測，且缺少妊娠期用藥安全性依據(jù)，增加了妊娠期婦女的用藥顧慮。中藥的發(fā)育毒性試驗不僅關(guān)注妊娠期禁忌藥的藥理毒性，同時還延伸到生殖發(fā)育毒性和遺傳毒性領(lǐng)域[6]。從中藥對動物發(fā)育毒性的Meta分析可知，中藥可能會降低母體的體質(zhì)量和增加流產(chǎn)的風險。由于外觀和內(nèi)臟畸形發(fā)生率較低，難以判定中藥是否會導致動物畸形的發(fā)生。但部分具有保胎活性的中藥（如黃芩、漢黃芩素、滋育養(yǎng)胎丸），可使動物胎仔的骨骼發(fā)育延緩或骨化不全[13，27，35，38]。此外，值得注意的是，藥物對不同種族妊娠狀態(tài)下母體和胎兒的毒性不盡相同，如“沙利度胺事件”，沙利度胺在動物毒性實驗階段未發(fā)現(xiàn)胎仔畸形，而作用于人體時可出現(xiàn)肢體的畸形。有研究表明，中藥雄黃對孕兔的母體毒性比對孕鼠的母體毒性更明顯，可下降孕兔的活胎率和增加晚期胚胎流失增加，但未發(fā)現(xiàn)明顯的致畸作用[16]，因此對中藥的致畸風險毒性的評價，需更多臨床妊娠期用藥數(shù)據(jù)的支持。妊娠期不同胎齡用藥影響也不盡相同，如在妊娠前或妊娠早期給予孕鼠朱砂，可升高孕鼠的體內(nèi)汞蓄積量，可增加流產(chǎn)率和吸收胎率，在妊娠中晚期給予孕鼠朱砂，胚胎對朱砂的敏感性降低，而對胚胎發(fā)育的影響較小[39]。因此，妊娠期中藥對胎兒的致畸風險仍需考慮母體的疾病狀態(tài)、中藥的特性、中藥的劑量、中藥的暴露時間、藥物和受體的親和力、用藥時的胎齡等因素[40]。

本系統(tǒng)評價所納入研究中，干預措施存在較大差異，其中納入研究的干預中藥包括清熱藥、保胎藥、扶正劑、活血藥、補氣養(yǎng)血藥等，其藥理活性、臨床應用及妊娠期用藥安全性存在較大差異。干預中藥的劑型包括飲片、單體、提取液及中藥制劑，存在較大差異。此外，納入研究的質(zhì)量較低，對于動物隨機對照實驗，多數(shù)研究未按國際及國內(nèi)《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導原則》標準進行，各研究結(jié)果間的報告亦存在較大差異。

本研究由于檢索詞范圍較廣，部分中藥可能檢索不全。納入研究均為已發(fā)表在核心期刊的中文和英文文獻，缺乏未發(fā)表的文獻和難以獲取的臨床前藥物毒性實驗的數(shù)據(jù)。納入研究動物樣本量較小，研究文獻的質(zhì)量較低。由于目前對于妊娠期禁用中藥的發(fā)育生殖毒性的研究不足，納入的30 篇文章中，僅8 篇屬妊娠期禁用中藥，使最終的報告結(jié)果存在發(fā)表偏倚。各研究存在中藥種類、中藥劑型、動物種屬、干預措施和干預時段不同，可增加各研究間的異質(zhì)性。因此，限于納入研究的質(zhì)量和數(shù)量，該系統(tǒng)研究的結(jié)果仍需更多大樣本、高質(zhì)量的不同種類中藥動物發(fā)育毒性實驗驗證。