骨康寧洗劑皮膚刺激性和過敏性實(shí)驗(yàn)研究*

張曉萌，王康俊，陳國彪，王巨才

（海南省藥品檢驗(yàn)所·海南省藥物質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570216）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）為嚴(yán)重影響中老年患者生活質(zhì)量的慢性退行性疾病，屬中醫(yī)“痹證”范疇，中醫(yī)藥在臨床治療KOA 中發(fā)揮了重要作用。骨康寧洗劑主要由紅花、防風(fēng)、當(dāng)歸、羌活、血竭組方，主要功效為活血止痛、通絡(luò)除濕，可用于治療膝骨關(guān)節(jié)功能障礙、風(fēng)寒濕痹引起的關(guān)節(jié)炎等。為保證骨康寧洗劑臨床用藥的安全、有效、可控，根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局《證候類中藥新藥臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及原國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評(píng)審中心《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的指導(dǎo)原則》《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光變態(tài)反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》等文件，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)骨康寧洗劑的皮膚刺激性和過敏性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為其臨床應(yīng)用提供參考[1]?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CP225D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；UW8200S 型電子天平（日本Shimadzu 公司）；RTZ－10A－RT 型嬰兒秤（無錫市衡器廠有限公司）。

試藥：骨康寧洗劑（駐馬店骨科醫(yī)院自制，批號(hào)為20191101）；2，4－二硝基氯代苯（上海試劑一廠，批號(hào)為89－09－01）；丙 酮（洛 陽 市 化 學(xué) 試 劑 廠，批 號(hào) 為130304）；水為娃哈哈純凈水。

動(dòng)物：健康成年日本大耳家兔8 只，普通級(jí)，體質(zhì)量2.0 ～3.0 kg，雌雄各半，購自華蘭生物疫苗有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2020－0003，合格證號(hào)為NO.1109662011000098。健康Hartely 白色豚鼠，普通級(jí)，體質(zhì)量250 ～350 g，雌雄不拘（雌性無孕或未曾產(chǎn)仔），購自陜西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2017－001，合格證號(hào)為NO.61003200000425。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室符合國家相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)期間家兔單籠飼養(yǎng)，豚鼠雌雄分籠飼養(yǎng)、每籠5 只，環(huán)境溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度50% ～65%，光照明暗交替各12 h，動(dòng)物自由飲水、攝食，通風(fēng)良好，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

分組：取家兔8 只，隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，每組4 只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前24 h，用理發(fā)器對(duì)家兔背部（脊柱兩側(cè)）進(jìn)行剃毛，再用6%硫化鈉溶液進(jìn)行脫毛，去毛范圍左、右各10 cm×10 cm。破損皮膚組在用藥部位用無菌8 號(hào)針頭劃“井”字，以滲血為度制備破損皮膚。給藥前檢查去毛皮膚的完整性，有損傷者不得納入完整皮膚組。

給藥：采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，取紗布7.5 cm×7.5 cm，4 層，浸骨康寧洗劑原液（20 mL，參照人體用法用量），貼于左側(cè)已去毛的皮膚上，用塑料薄膜覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶固定；右側(cè)皮膚同法貼敷純凈水（20 mL）浸潤紗布，作為空白對(duì)照。貼敷6 h 后，除去受試物后用溫水清潔給藥部位，破損皮膚采用無菌操作。每天給藥1 次，連續(xù)7 d。

觀察指標(biāo)：?jiǎn)未谓o藥時(shí)于首次貼敷去除藥物后1，24，48，72 h，多次給藥時(shí)于每次去除藥物后1 h，肉眼觀察并記錄貼敷部位是否有紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況，以及發(fā)生時(shí)間和消退時(shí)間。如存在持久性損傷，則延長觀察期限，以評(píng)價(jià)上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間（不超過14 d）。對(duì)于出現(xiàn)中度及中度以上皮膚刺激性的家兔，在觀察期結(jié)束時(shí)對(duì)給藥局部進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無紅斑、輕度紅斑、中度紅斑、重度紅斑和水腫性紅斑分別計(jì)0，1，2，3，4 分；無水腫、輕度水腫、中度水腫、重度水腫、嚴(yán)重水腫分別計(jì)0，1，2，3，4 分（過敏反應(yīng)中后2 種水腫均計(jì)3 分）。刺激分值＝（紅斑積分＋水腫積分）／動(dòng)物只數(shù)。刺激分值＜0.50 為無刺激性，0.50 ～2.99 為輕度刺激性，3.00 ～5.99 為中度刺激性，6.00 ～8.00 為強(qiáng)度刺激性。

1.2.2 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)

分組：取豚鼠40 只，隨機(jī)分為藥物組（20 只）、空白對(duì)照組（10 只）和模型組（10 只）。致敏前24 h，用理發(fā)器對(duì)豚鼠脊柱左側(cè)進(jìn)行剃毛，再用6%硫化鈉溶液脫毛，去毛范圍10 cm×6 cm，激發(fā)前24 h 同法對(duì)脊柱右側(cè)進(jìn)行脫毛處理。

給藥：致敏，各組分別于第0，7，14 天對(duì)左側(cè)去毛皮膚給予骨康寧洗劑（20 mL）、純凈水（20 mL）和1% 2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液（0.2 mL），將骨康寧洗劑和純凈水分別浸入4 層7.5 cm×7.5 cm 的紗布后貼于左側(cè)去毛皮膚上，2，4－二硝基氯代苯丙酮溶液均勻涂于左側(cè)去毛皮膚上，均用塑料薄膜覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定，貼敷6 h 后除去受試物，用溫水清潔給藥部位。激發(fā)，首次致敏后第28 天，各組豚鼠右側(cè)去毛區(qū)貼敷受試物，操作同致敏給藥。

觀察指標(biāo)：激發(fā)給藥后24，48 h 觀察豚鼠皮膚紅斑、水腫等過敏反應(yīng)癥狀并評(píng)分，同時(shí)密切觀察豚鼠是否有哮喘、站立不穩(wěn)、休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)出現(xiàn)。如結(jié)果難以判定，1 周后再次激發(fā)。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：基本同皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)，但最高分1 分。皮膚過敏反應(yīng)積分≥1 分的均判為皮膚過敏反應(yīng)陽性，強(qiáng)度分為弱敏性、輕度致敏、中度致敏、強(qiáng)致敏、極強(qiáng)致敏，對(duì)應(yīng)的過敏反應(yīng)發(fā)生率分別為0 ～8%，9% ～28%，29% ～64%，65% ～80%，81% ～100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

單次給藥后，破損皮膚組和完整皮膚組家兔的受試皮膚未見明顯異常。多次給藥后，破損皮膚組2 只家兔受試皮膚出現(xiàn)不規(guī)律的輕度紅斑，24 h 后紅斑消失，均未見色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄、水腫現(xiàn)象發(fā)生。完整皮膚組家兔的皮膚未見明顯異常。詳見表1。

表1 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

表1 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（± s，分，n ＝4）Tab.1 Results of skin irritation test in rabbits（± s，point，n ＝4）

時(shí)間點(diǎn)完整皮膚組 破損皮膚組骨康寧洗劑純凈水骨康寧洗劑純凈水單次給藥后 1 h 24 h 48 h 72 h多次給藥后 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 0 0 00 0 00 0 00 0 0 0 00 0 00 0 00 0 000000 0.25±0.5 00 0.25±0.5 0 0 000 000 000 0

外用藥對(duì)破損皮膚有輕微的刺激性是普遍現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)中，破損皮膚組的家兔受試皮膚出現(xiàn)的輕度紅斑無規(guī)律性，持續(xù)時(shí)間短，與自身空白對(duì)照比較無明顯差異（P ＞0.05），考慮為建模、活動(dòng)剮蹭時(shí)的刺激引起，非藥物引起的刺激反應(yīng)。

2.2 皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)

激發(fā)給藥24 h 和48 h 后，模型組豚鼠皮膚出現(xiàn)重度紅斑、中度水腫，致敏率100%，藥物組和空白對(duì)照組豚鼠皮膚未見過敏現(xiàn)象，未出現(xiàn)哮喘、站立不穩(wěn)、休克等嚴(yán)重的全身性過敏反應(yīng)（P ＜0.05），可判斷骨康寧洗劑無致敏性。詳見表2。

表2 豚鼠激發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the stimulation test in guinea pigs

3 討論

KOA 主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、功能障礙，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至喪失功能，影響患者的正常生活和工作[2]?！断ス顷P(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療指南（2020 年版）》指出，中草藥／成藥外用適用于KOA 的發(fā)作期、緩解期、康復(fù)期。對(duì)治療KOA 的中成藥組方規(guī)律進(jìn)行分析[3]，涉及的289 味中藥用藥頻次排序，當(dāng)歸（75 次）第1，紅花（53 次）第3，羌活（47 次）第6，防風(fēng)（45 次）第8；常用藥材組合中，當(dāng)歸－羌活出現(xiàn)頻率排第3。

骨康寧洗劑組方中，紅花所含紅花黃素屬查耳酮類化合物，可通過抗氧化、抑制一氧化氮產(chǎn)生、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用[4]。金曉東等[5－6]的研究結(jié)果顯示，紅花能降低兔關(guān)節(jié)液中前列腺素E2和白細(xì)胞介素8的含量，通過抑制上述致炎因子起到抑制關(guān)節(jié)炎癥的作用。防風(fēng)含有色原酮、多糖、揮發(fā)油、香豆素等化學(xué)成分，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性[7－8]。當(dāng)歸所含揮發(fā)油藁本內(nèi)酯具有良好的鎮(zhèn)痛作用，有機(jī)酸阿魏酸可抑制血小板聚集、改善血液循環(huán)，當(dāng)歸多糖的活血功效顯著[9]。羌活主要含羌胡醇、異歐前胡素、阿魏酸苯乙醇酯、揮發(fā)油等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛的藥理作用，與當(dāng)歸配伍可祛風(fēng)止痛，與防風(fēng)配伍可宣通氣血[10]。血竭主要成分為黃酮類、苯丙素類、皂苷類、甾醇類等，具有活血化瘀、消腫止痛功效[11]，被譽(yù)為活血化瘀“圣藥”。我國現(xiàn)有的血竭是百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹Dracaeua cochiuchiueusis（Lour.）S.C.Chen. 和海南龍血樹Dracaena cambodiaua Pierre ex Gagnep. 的樹脂提取而成，其基源植物主要分布在我國廣西和海南一帶，劍葉龍血樹所產(chǎn)血竭，又稱國產(chǎn)血竭或廣西血竭，在1991 年被國家批準(zhǔn)為一類新藥（藥材），海南龍血樹所產(chǎn)血竭也被收入海南省地方標(biāo)準(zhǔn)[12]。

骨康寧洗劑用于關(guān)節(jié)功能障礙、跌打損傷、腰肌勞損及風(fēng)寒濕痹所致關(guān)節(jié)炎等癥狀的治療，主要通過熏洗、敷貼等方式作用于體表皮膚，故有必要通過建立動(dòng)物模型進(jìn)行安全性的初步研究。皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)中，破損皮膚組的家兔出現(xiàn)過不規(guī)律的輕度紅斑，持續(xù)時(shí)間短，與自身空白對(duì)照比較無明顯差異，考慮為破損皮膚建模、家兔活動(dòng)剮蹭時(shí)的刺激所引起，非藥物引起的刺激反應(yīng)。皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)中，藥物組豚鼠未見局部和全身過敏反應(yīng)。在所設(shè)實(shí)驗(yàn)條件下，骨康寧洗劑未引起明顯的刺激性和致敏性反應(yīng)，局部用藥安全。