傳統(tǒng)中藥抗EV71的作用機(jī)制研究進(jìn)展

石 斌，劉正蕓，王 歡

(1.貴州省普通高等學(xué)校傳染病與生物安全特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099； 2.遵義醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒引起的急性腸道傳染病，好發(fā)于學(xué)齡前尤其是5歲以下兒童，其主要傳播途徑為消化道、呼吸道以及密切接觸。HFMD的致病微生物有柯薩奇病毒A組的4、5、9、10和16型，B組的2、4 和 5 型，以及腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)。EV71是HFMD的主要致病微生物之一[1]。其感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、小腦共濟(jì)失調(diào)等[2-3]。危重病例預(yù)后差，病死率和致殘率高。

EV71屬小RNA 病毒科病毒，病毒外殼是由 VP1、VP2、VP3 和 VP4 四種結(jié)構(gòu)蛋白組成。四種結(jié)構(gòu)蛋白中除VP4蛋白是包埋在病毒衣殼的內(nèi)側(cè)，且與核心緊密連接外，其他三種結(jié)構(gòu)蛋白均暴露于病毒顆粒的表面，因而抗原的決定簇主要位于VP1-VP3上。其中，VP1蛋白是EV71最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，它決定了病毒的抗原性和遺傳多樣性。

HFMD是常見(jiàn)的嬰幼兒傳染病，由于有效、特異抗病毒藥物的缺乏，臨床上目前多用干擾素、利巴韋林和甲潑尼龍等進(jìn)行聯(lián)合給藥治療，但對(duì)EV71引起的重癥HFMD效果差強(qiáng)人意，尋求新的、特異的抗EV71藥物對(duì)HFMD的預(yù)防及治療顯得尤為重要。我國(guó)傳統(tǒng)中藥抗病毒使用歷史悠久，涉及全面，傳統(tǒng)中藥通過(guò)抑制病毒增殖周期(吸附、穿入、脫殼、生物蛋白合成、釋放)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和改善臨床癥狀發(fā)揮抗病毒作用。探索傳統(tǒng)中藥抗病毒機(jī)制對(duì)我國(guó)中藥的發(fā)展和HFMD的治療顯得十分重要。本文對(duì)傳統(tǒng)中藥抗EV71的機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為HFMD的治療提供更多理論依據(jù)以及對(duì)中藥行業(yè)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 直接滅活EV71

直接滅活是藥物對(duì)病毒侵入細(xì)胞前的殺滅作用，阻斷病毒吸附、穿入、復(fù)制等環(huán)節(jié)從而達(dá)到抗病毒目的，是一種理想的抗病毒策略。研究表明：魚腥草水提液在體外具抗EV71病毒復(fù)制的活性，并且魚腥草水提液主要通過(guò)直接滅活EV71，導(dǎo)致病毒失活不能繼續(xù)感染[4]。同時(shí)，中藥海藻提取物也能直接滅活EV71，阻止EV71繼續(xù)感染[5]。

2 影響EV71的復(fù)制周期

2.1 影響病毒的吸附和穿入 病毒吸附宿主細(xì)胞表面是感染的第一步，吸附是病毒的表面吸附蛋白與易感細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合，它決定了病毒不同嗜組織性和感染宿主的范圍。穿入主要是病毒通過(guò)吞飲、融合、直接穿入等方式進(jìn)入細(xì)胞。

研究表明：疏清顆粒[6]、桂芪多糖(GQP)[7]、葛根水提取物[8]、清熱解毒化濁片[9]、金銀花-連翹[10]、紅景天苷[11]、水飛薊素[12]、升麻葛根湯(SMGGT)和荊芥[13]能通過(guò)抑制病毒吸附于細(xì)胞表面起到抗病毒作用。葛根水提取物和升麻葛根湯(SMGGT)通過(guò)非干擾素介導(dǎo)的抗病毒作用抑制EV71，對(duì)EV71感染引起的疾病有較好的防治作用。

金銀花-連翹、紅景天苷和荊芥不僅能抑制EV71的吸附，對(duì)EV71的穿入也有一定的抑制作用，可用于預(yù)防EV71感染。其中，荊芥抑制EV71誘導(dǎo)的p38激酶的激活，降低p38激酶的磷酸化.抑制hnRNPA1(異核糖體核蛋白A1)細(xì)胞質(zhì)重新定位和EPS15(胞吞調(diào)控蛋白)的翻譯后修飾，最終抑制EV71的感染和復(fù)制[13]。

丹參提取物SA1或SA2處理的培養(yǎng)物在病毒感染期間的抗病毒活性比感染前后處理的培養(yǎng)物更有效，提示這些可能會(huì)干擾病毒的進(jìn)入[14]。

2.2 影響病毒脫殼 許多腸道病毒(包括EV71)，其結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合后發(fā)生改變。EV71成熟病毒顆粒一般處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，病毒受體N端結(jié)構(gòu)域D1與衣殼蛋白上保守氨基酸殘基結(jié)合，觸發(fā)EV71的不穩(wěn)定和脫殼。

研究表明：兩種靈芝三萜(GLTA)和(GLTB)通過(guò)阻斷EV71脫殼顯著抑制病毒RNA的復(fù)制，通過(guò)計(jì)算機(jī)分子對(duì)接預(yù)測(cè)EV71病毒粒子與GLTA和GLTB之間的相互作用，結(jié)果表明GLTA和GLTB可能在一個(gè)疏水袋(F位點(diǎn))與病毒衣殼蛋白結(jié)合，從而阻礙了EV71的脫殼，顯著抑制病毒RNA(vRNA)在EV71復(fù)制中的復(fù)制[15]。

2.3 影響病毒生物合成 病毒mRNA在宿主細(xì)胞聚核糖體上翻譯合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白是病毒結(jié)構(gòu)的組成成分，非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制中具有調(diào)節(jié)催化病毒復(fù)制的酶類和調(diào)控蛋白等重要功能。在EV71 RNA復(fù)制過(guò)程中，病毒3D蛋白作為一種RNA依賴的RNA聚合酶，在胞質(zhì)中合成互補(bǔ)負(fù)鏈。RNA合成發(fā)生在病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞膜小泡外表面的復(fù)制復(fù)合體中，新合成RNA從復(fù)制復(fù)合體中釋放出來(lái)，可能進(jìn)入另一輪的翻譯和復(fù)制，或通過(guò)衣殼蛋白包裹產(chǎn)生子代病毒。

2.3.1 影響EV71核酸合成 梔子苷通過(guò)抑制病毒IRES的活性，減少EV71引起的空斑，有效抑制EV71 RNA的合成[16]。芒柄花黃素抑制EV71誘導(dǎo)的cox2的表達(dá)和MAPKs通路中ERK和p38的產(chǎn)生，降低EV71 RNA和蛋白的合成，且呈劑量依賴性[17]。金花菊素和潘杜萊素不是通過(guò)阻斷病毒進(jìn)入或直接滅活病毒而發(fā)揮作用，而是通過(guò)抑制病毒RNA復(fù)制而發(fā)揮作用，抑制子代病毒產(chǎn)生和RNA復(fù)制的抑制率幾乎為100%[18]。黃酮類化合物可以減少病毒基因組RNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成[19]。姜黃素在感染EV71的Vero細(xì)胞中，顯著抑制病毒RNA的合成、病毒蛋白的表達(dá)和子代病毒的產(chǎn)生，同時(shí)還證實(shí)姜黃素在病毒感染早期具有抗凋亡活性[20]。木犀草素通過(guò)抑制病毒RNA復(fù)制來(lái)靶向EV71和CA16，發(fā)揮抗腫瘤作用[21]。丹參提取物SA1和SA2能夠抑制病毒在感染細(xì)胞中RNA的合成，抑制EV71感染引起的細(xì)胞凋亡[22]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸鹽抑制EV71誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，降低EV71在G-6-PD缺陷細(xì)胞中的毒力，抑制病毒基因組RNA的復(fù)制[23]。

2.3.2 影響EV71蛋白合成 泡桐的有效成分芹黃素通過(guò)阻斷病毒RNA與hnRNP A1和A2蛋白的關(guān)聯(lián)抑制EV71感染，通過(guò)破壞宿主因子與病毒RNA的關(guān)聯(lián)來(lái)抑制EV71感染，這是一種新的黃酮類抗病毒活性機(jī)制[24]。綠原酸主要通過(guò)干擾EV71復(fù)制早期2A mRNA表達(dá)和蛋白翻譯而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)，同時(shí)對(duì)EV71感染的抑制效應(yīng)與阻止病毒吸附無(wú)關(guān)[25]。芹菜素阻止了EV71 RNA與hnRNP A1和A2蛋白的關(guān)聯(lián)，抑制hnRNP A1和A2的表達(dá)從而顯著降低EV71感染[26]。FlosFarfarae提取物可能通過(guò)阻止結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制而抑制EV71感染[27]。細(xì)葉青葉提取物可以滅活病毒2A蛋白酶，降低IL-6和RANTES表達(dá)，呈濃度依賴性，能減少CPE、使斑塊和病毒產(chǎn)量降低，可顯著抑制EV71的復(fù)制[28]。大黃素能有效抑制EV71蛋白的復(fù)制、抑制了EV71感染引起的細(xì)胞死亡，并顯著減少由EV71感染引起的MRC5細(xì)胞的S期阻滯[29]。喹吖啶對(duì)EV71 RNA復(fù)制、病毒衣殼蛋白的表達(dá)和病毒的生成均有較強(qiáng)的抑制作用[30]。番茄紅素通過(guò)抑制病毒蛋白合成、阻斷病毒蛋白在翻譯過(guò)程中的延伸、抑制病毒復(fù)制，降低病毒對(duì)RD細(xì)胞的細(xì)胞病變作用(Cytopathogenic effect，CPE)[31]。

2.3.3 其他 黃芩苷可能通過(guò)抑制EV71 3D聚合酶表達(dá)和抑制Fas/FasL信號(hào)通路從而抑制EV71感染引起的RD細(xì)胞的凋亡[32]。槲皮素具有預(yù)防EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、感染和抑制病毒吸附的作用，能夠有效地抑制EV71 3C pro活性從而阻止EV71復(fù)制[33]。金羧酸(ATA)能夠抑制EV71的RdRp活性、干擾EV71的3D聚合酶，有效抑制EV71復(fù)制[34]。

3 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)和細(xì)胞因子HT

病毒入侵機(jī)體后，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫，包括T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫與B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，主要依靠特異性T細(xì)胞活化發(fā)揮免疫效應(yīng)，以及依靠B細(xì)胞產(chǎn)生特異性的抗體發(fā)揮免疫效應(yīng)，達(dá)到清除病毒的目的。

喜炎平注射液在國(guó)內(nèi)被推薦用于治療重癥HFMD，其對(duì)EV71致死性攻擊的小鼠具有保護(hù)作用，可能主要依賴于其對(duì)中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的直接免疫調(diào)節(jié)活性[35]。甘露消毒丹能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a、miR-155及TLR4來(lái)調(diào)控EV71所致炎癥及免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗EV71的作用，同時(shí)還能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應(yīng)來(lái)間接抗病毒[36]。白藜蘆醇通過(guò)阻斷RD細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路抑制炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌，從而抑制EV71復(fù)制[37]。馥感啉口服液可通過(guò)提高免疫力增強(qiáng)吞噬功能，改善因病毒感染導(dǎo)致的免疫功能紊亂狀態(tài)，從根本上改善EV71感染所致HFMD患兒體內(nèi)的免疫紊亂[38]。清熱解毒化濁片通過(guò)影響EV71的吸附和復(fù)制，提高細(xì)胞免疫，達(dá)到抑制EV71復(fù)制的效應(yīng)[39]。清熱抗毒煎劑通過(guò)增加細(xì)胞因子活性，改善HFMD患兒免疫功能，達(dá)到抗EV71的作用[40]。

4 臨床有效的中藥

西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HFMD是由腸道病毒引起的傳染性疾病，臨床治療以抗病毒為主，其他治療主要是對(duì)癥治療及預(yù)防并發(fā)癥；中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，HFMD屬于中醫(yī)學(xué)“溫病”范疇，治療宜清熱解毒，宣肺化痰，辛涼透疹，芳香化濕，宣散脾胃郁熱。無(wú)論中醫(yī)或是西醫(yī)，最終目的都是為患兒減輕病痛困擾，減少毒副作用和減輕家庭經(jīng)濟(jì)壓力。目前，臨床使用很多中藥制劑治療HFMD，和西藥治療相比，其療效優(yōu)于西藥常規(guī)治療。

熱毒寧注射液治療EV71引起的重癥HFMD具有起效快、退熱迅速的特點(diǎn)[41]。熱毒寧注射液和蒲地藍(lán)消炎口服液聯(lián)合給藥時(shí)，其在改善發(fā)熱、皰疹癥狀方面療效優(yōu)于炎琥寧注射液和雙黃連口服液聯(lián)合給藥,能明顯縮短療程，提高治愈率[42]。在注射用單磷酸阿糖腺苷治療的基礎(chǔ)上，采用連花清瘟顆粒和熱毒寧注射液聯(lián)合治療，能提高治療效果，也縮短了療程，其療效明顯優(yōu)于單純應(yīng)用單磷酸阿糖腺苷及連花清瘟顆粒和熱毒寧注射液治療[43]。痰熱清注射液與注射用單磷酸阿糖腺苷治療HFMD進(jìn)行比較，結(jié)果顯示痰熱清注射液能夠明顯改善小兒HFMD(普通型)的臨床癥狀(皮疹、發(fā)熱、咽紅、咽痛)，療效確切[44]。清瘟敗毒飲結(jié)腸滴注為治療組與西醫(yī)常規(guī)治療比較，顯示清瘟敗毒飲結(jié)腸滴注治療重癥HFMD時(shí)熱退時(shí)間、住院時(shí)間都比西醫(yī)常規(guī)治療短，療效確切，無(wú)副作用[45]。

馥感啉口服液可通過(guò)提高HFMD患兒免疫力，增強(qiáng)吞噬功能，改善因病毒感染導(dǎo)致的免疫功能紊亂，針對(duì)免疫力低下反復(fù)呼吸道感染的患兒，馥感啉口服液的有效率為92.9%[46]。與利巴韋林相比，黃芩可快速退熱，減輕口腔病變和皮疹，改善神經(jīng)系統(tǒng)受損，適用于1歲以上嚴(yán)重HFMD患兒的治療[47]。金銀清瘟湯聯(lián)合西藥治療小兒EV71型HFMD肺脾濕熱證比單純用西藥治療效果佳[48]。中藥清熱抗毒煎劑能夠增加細(xì)胞因子活性，改善HFMD患兒免疫功能，增強(qiáng)患兒抗EV71的能力[40]。除了中藥制劑外，中藥穴位貼敷、中藥灌腸等聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療HFMD也能獲得較為滿意的療效[49]。

5 結(jié)束語(yǔ)

目前HFMD的治療仍以對(duì)癥治療為主，主要包括隔離、積極控制高熱、控制并發(fā)癥等，尚缺乏有效的抗病毒藥物，尋找無(wú)毒副作用，安全有效的抗病毒藥物顯得格外重要。我國(guó)中藥資源豐富，且中藥具有許多化學(xué)藥物所不具備的優(yōu)點(diǎn)——毒副作用小。本文從直接滅活EV71、影響EV71的復(fù)制周期(吸附、穿入、脫殼和生物合成)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)和細(xì)胞因子及臨床有效的中藥四個(gè)方面展開(kāi)敘述，介紹了目前中藥制劑在發(fā)揮抗EV71作用時(shí)的具體機(jī)制(見(jiàn)表1)。普遍而言，中藥抗EV71的研究還停留在效應(yīng)層面，主要以減輕患兒癥狀為主，對(duì)中藥抗EV71的機(jī)制進(jìn)行深入研究，有利于提高中藥抗EV71的研究水平，對(duì)EV71以至病毒領(lǐng)域都有較大的科學(xué)意義。

表1 中藥抗EV71的作用機(jī)制