基于TLR2/MyD88/NF-κB信號通路探討不可分型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)支氣管上皮細胞炎癥的機制

周欣欣，張曉宇，周 輝，王小妹

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410000; 2.湖南省第二人民醫(yī)院 手足外科，湖南 長沙 410000)

不可分型流感嗜血桿菌(Nontypeable haemophilus influenzae，NTHi)為革蘭陰性桿菌,無莢膜，常寄居于人類上呼吸道，是重要的機會致病菌，能引起肺炎等炎癥反應(yīng)[1]。研究表明[2]，NTHi 在感染呼吸道過程中主要通過釋放內(nèi)毒素、以及蛋白水解酶等毒性產(chǎn)物，促進呼吸道粘膜炎癥因子釋放進而導(dǎo)致組織炎癥反應(yīng)。而過度的呼吸道炎癥反應(yīng)將進一步誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生[3]，因此有效預(yù)防NTHi感染所致的炎癥反應(yīng)在臨床COPD的防治應(yīng)用中具有重要意義。

多種調(diào)控機制參與NTHi在感染呼吸道上皮細胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的過程。已有研究證實，NTHi感染肺泡上皮細胞株，能夠激活p38 MAPK信號通路進而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[4]。此外，NTHi同樣也可以通過ERK MAPK信號通路來上調(diào)肺泡上皮細胞株A549炎癥因子IL-8的分泌[5]。盡管如此，但到目前為止我們?nèi)圆磺宄﨨THi具體的致炎機制。因此，本研究將以NF-κB信號通路為切入點，明確NTHi誘導(dǎo)人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B產(chǎn)生炎癥因子的分子機制，進而為預(yù)防及治療NTHi感染相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 不可分型流感嗜血桿菌菌株(ATCC-49247)采購自美國ATCC公司；人正常支氣管上皮細胞(BEAS-2B)采購于中科院細胞庫；Human IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自Invitrogen公司；TLR2干擾RNA購自InvivoGen公司；MyD88抑制劑NBP2-29328購自Sigma公司；NF-κB抑制劑(BAY11-7082)購自Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；IκB、β-actin抗體采購于Cell Signaling Technology公司； PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 細胞處理 將新配置的DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)加入BEAS-2B細胞中，并將細胞至于37 ℃、5 % CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，重新處理細胞并放至6孔板中培養(yǎng)，進行如下處理：以MOI=1、5、10的NTHi感染細胞24 h，并收集細胞及細胞上清液于-20 ℃保存待用。

1.3 ELISA檢測 按照IL-6、IL-1βELISA檢測試劑盒說明書的要求，對上述處理后的細胞上清中細胞因子的水平進行檢測。檢測完成后，用酶標儀對各組細胞樣本的OD值進行測定(450 nm)，每種實驗重復(fù)3次。采用試劑盒中標準品的檢測結(jié)果繪制標準曲線，進而對各細胞上清液中IL-6、IL-1β的表達水平進行計算。

1.4 定量PCR檢測 按照Trizol試劑盒說明書步驟，提取上述收集細胞的總RNA，進行純化后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)，隨后按照RT-PCR反應(yīng)體系進行引物擴增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。引物設(shè)計如下：IL-1βF：TGGCAATGAGGATGACTTGT；R： TGGTGGTCGGAG-ATTCGTA。IL-6 F：TACATCCTCGACGGCATCTC；R： TTTCAGCCATCTTTGGAAGG。TLR2 F：GCTCCTGCGAACTCCTATCC；R： CAAAGAGACTCCAGACACCAG。MyD88 F：CCGCCTGTCTCTGTTCTTG；R： GTCGCTTGTGTCTCCAGTT。擴增完畢后，使用2-△Ct法計算IL-1β、IL-6、以MyD88及TLR2 mRNA相對的表達量。

1.5 RNA干擾 RNA干擾實驗采用非特異性特異性TLR2靶向siRNA(InvivoGen)和siRNA(siRNA control，NWG Biotech)。參照Nucleofector試劑盒說明書操作：取2 μg(約25 nmol/L)siRNA轉(zhuǎn)染到106個BEAS-2B細胞中，培養(yǎng)48 h后，再繼續(xù)用NTHi處理24 h，隨后收集細胞及上清用于后續(xù)實驗。

1.6 Western blot檢測 收集處理后的細胞，在細胞中加入150 μL細胞裂解液，反復(fù)吹打均勻，1 500 rpm離心10 min后收集上清。隨后取10 μL蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，并于轉(zhuǎn)膜儀中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后4℃封閉過夜，隨后分別用稀釋好的一抗和二抗進行孵育并進行ECL發(fā)光顯影(顯影儀中)。

2 結(jié)果

2.1 NTHi誘導(dǎo)BEAS-2B細胞分泌IL-1β和IL-6 為了明確NTHi對BEAS-2B細胞分泌促炎因子的影響，NTHi刺激后ELISA檢測細胞上清炎癥因子水平。結(jié)果顯示用MOI=1、5、10的NTHi感染BEAS-2B細胞24h后，細胞上清中IL-1β和IL-6顯著增高，且呈濃度依賴性(見圖1)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖1 NTHi刺激BEAS-2B細胞分泌IL-1β以及IL-6

2.2 NTHi誘導(dǎo)BEAS-2B細胞表達IL-1β和IL-6 mRNA 進一步采用qRT-PCR對BEAS-2B細胞中IL-1β和IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果一致，MOI=1、5、10的NTHi感染BEAS-2B細胞24 h時，隨著NTHi濃度的增高，IL-1β和IL-6 mRNA的表達量顯著增高(見圖2)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖2 NTHi誘導(dǎo)BEAS-2B細胞IL-1β以及IL-6 mRNA表達

2.3 抑制NF-κB信號通路下調(diào)NTHi誘導(dǎo)IL-1β和IL-6分泌 Western blot結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞后，細胞內(nèi)IκB的磷酸化水平(p-IκB)較未感染組顯著上升(見圖3A)。而進一步采用10μMNF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理后NTHi感染細胞，結(jié)果顯示細胞內(nèi)IL-1β和IL-6水平顯著減少(見圖3B)。

*：與MOI=0相比， P<0.05；#：與MOI=10，BAY11-7082(—)相比，P<0.05。圖3 NTHi激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)BEAS-2B細胞分泌IL-1β以及IL-6

2.4 NTHi感染BEAS-2B細胞激活TLR2以及MyD88 為了明確TLR2以及MyD88在NTHi誘導(dǎo)IL-1β和IL-6分泌中的作用。NTHi感染BEAS-2B細胞后，我們采用RT-PCR檢測細胞內(nèi)TLR2以及MyD88的活化情況。結(jié)果顯示，NTHi刺激后細胞內(nèi)TLR2以及MyD88的表達水平均要顯著高于未感染對照組(見圖4)。

*：與MOI=0相比， P<0.05。圖4 NTHi感染BEAS-2B細胞活化TLR2以及MyD88

2.5 沉默TLR2/ MyD88下調(diào)IL-1β和IL-6分泌 進一步采用siRNA以及MyD88抑制劑處理細胞，并檢測細胞上清IL-1β和IL-6的分泌水平。結(jié)果顯示，siRNA沉默TLR2后，BEAS-2B細胞中IL-1β和IL-6分泌水平較未沉默的對照組顯著降低(見圖5)。此外，采用MyD88抑制劑處理后細胞中IL-1β和IL-6的分泌水平也顯著降低(見圖6)。

*：與MOI=0，siRNA(—)相比， P<0.05；#：與MOI=10，siRNA(—)相比， P<0.05。圖5 抑制TLR2下調(diào)IL-1β和IL-6表達

*：與MOI=0，inhibitor(—)相比，P<0.05；#：與MOI=10，inhibitor(—)相比，P<0.05。圖6 抑制MyD88下調(diào)IL-1β和IL-6表達

3 討論

NTHi是常寄生于上呼吸道的條件致病菌，是引起COPD加重的主要因素[3]。目前體內(nèi)外實驗已經(jīng)證實[6]，NTHi可誘導(dǎo)呼吸道上皮細胞分泌IL-1β、IL-8、TNF-α、ICAM-1等多種促炎細胞因子以及趨化因子，進而介導(dǎo)NTHi感染后的炎癥反應(yīng)。然而到目前為止，關(guān)于NTHi誘導(dǎo)呼吸道炎癥反應(yīng)的具體分子機制仍未明了[7]。所以，探究NTHi的致炎機制對于開發(fā)設(shè)計相關(guān)的治療藥物至關(guān)重要。

炎癥反應(yīng)是NTHi致病的重要環(huán)節(jié)，NTHi感染呼吸道上皮細胞后分泌趨化因子以及炎癥因子是導(dǎo)致呼吸道以及肺組織病理損傷的一個關(guān)鍵因素[8]。過度的炎癥反應(yīng)還可以導(dǎo)致細胞產(chǎn)生明顯的毒性作用，進而誘發(fā)組織病理損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)[9]，NTHi或能夠誘導(dǎo)呼吸道細胞分泌炎癥因子IL-8。而本研究中，NTHi感染支氣管上皮BEAS-2B細胞后，能夠明顯誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。由于IL-1β是機體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，能促進其它促炎細胞因子的產(chǎn)生及分泌[8]。而IL-6是一種促炎細胞因子，則能夠直接參與機體的炎癥反應(yīng)，與組織炎性損傷密切相關(guān)[10]。因此，我們的結(jié)論與之前的研究相符。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其能夠?qū)⑼饨绲拇碳ば盘栍行鲗?dǎo)至細胞內(nèi)，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞分化以及正常細胞和惡性細胞的存活中發(fā)揮重要作用[11]。此外，NF-κB活化后還可通過調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答參與機體組織的炎癥反應(yīng)。已有研究證實[12]，NTHi可通過活化宿主細胞NF-κB信號通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8。而本研究結(jié)果顯示，NTHi感染BEAS-2B細胞后可明顯誘導(dǎo)細胞內(nèi)IκB的磷酸化水平，提示NF-κB信號通路被激活。而進一步采用NF-κB抑制劑BAY11-7082預(yù)處理細胞，細胞內(nèi)IL-1β和IL-6的表達水平均顯著降低，證實NF-κB也參與了NTHi誘導(dǎo)的IL-1β和IL-6分泌。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一種非常重要的天然免疫(非特異性免疫)識別受體，它能夠有效連接非特異性免疫和特異性免疫,參與多種細胞、組織、疾病的發(fā)生發(fā)展[13-16]。TLR2可以有效識別革蘭陰性菌的脂多糖，通過活化細胞內(nèi)的多條信號通路，進而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[17]。有研究表明[18-19]，TLR2能夠參與多種呼吸道病原體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其中就包括衣原體，肺炎支原體等；在本次研究中，siRNA沉默TLR2后能夠明顯抑制 IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，說明TLR2通路可能參與了NTHi對炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。MyD88是TLRs信號通路中的一個關(guān)鍵接頭分子，在傳遞上游信息和相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。課題組進一步采用MyD88抑制劑對細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)NTHi誘導(dǎo)IL-1β和IL-6分泌也同樣受到抑制。

綜上所述，本研究證實NTHi能夠誘導(dǎo)支氣管上皮BEAS-2B細胞分泌IL-1β和IL-6，且該機制或與TLR2/ MyD88及NF-κB信號通路的活化相關(guān)聯(lián)。但TLR2/ MyD88以及NF-κB信號通路活化后的作用機制目前尚未明了，有待進一步探討。本研究為闡明NTHi的致炎機制及臨床防治、治療NTHi感染提供了實驗基礎(chǔ)。