抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)的構(gòu)建及其在HA桿部抗體應答研究中的初步應用

何 江，蘇 敏，劉?；?，張 柯，陳 瑤，龍兆釔，袁棟波，董俊杰，何張祎檬，黃俊瓊

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 輸血科，貴州 遵義 563099；2.遂寧市中心醫(yī)院 輸血科，四川 遂寧 629200；3.遵義醫(yī)科大學臨床醫(yī)學系，貴州 遵義 563099；4.長沙醫(yī)學院中醫(yī)學院，湖南 長沙 410219)

不同亞型流感病毒尤其同一進化組內(nèi)血凝素(Hemaglutinin,HA)桿部相對保守，針對HA桿部的抗體可與不同亞型流感病毒發(fā)生交叉結(jié)合。然而，通常情況下針對血凝素的抗體應答以HA頭部為優(yōu)勢，流感病毒感染或疫苗接種后血清桿部抗體水平很低，難以用常規(guī)方法檢測。Luminex是在有色微球、激光技術、應用流體學及高速數(shù)字信號處理技術的基礎上發(fā)展起來的一種多功能液相分析平臺，檢測靈敏度高，可同時快速測定多達50種流感毒株的抗流感病毒HA抗體濃度。本研究利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達嵌合血凝素蛋白cH5/3，它由流感病毒H5頭部和病毒H3桿部組成，正常人群體內(nèi)不存在抗H5流感病毒抗體，因此cH5/3只能檢測到針對H3桿部的抗體，將純化的cH5/3蛋白與有色微球偶聯(lián)后構(gòu)建Luminex檢測體系，用于流感病毒誘導HA桿部抗體的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 四價流感病毒裂解疫苗購自華蘭生物公司；Bio-Plex? Amine Coupling Kit和Bio-Plex Pro Magnetic COOH Beads購自Bio-Rad公司；BSA和蛋白偶聯(lián)試劑盒購自Sigma公司；His-Tag (D3I1O) XP? Rabbit mAb(CST)、Goat anti-rabbit IgG-PE和Goat anti-human IgG-PE購自SouthernBiotech公司；Sf9細胞系購自上海研一公司；滅活H7N9禽流感病毒由中國科學院微生物研究所畢鈺海教授惠贈。

1.2 對象 本研究共招募12名健康志愿者，年齡19～32歲，平均23歲。所有受試者均為健康成人，未接種過流感疫苗，無自身免疫性疾病，未使用激素或免疫抑制劑。該項目獲得遵義醫(yī)科大學醫(yī)學倫理會批準，并與所有志愿者簽署書面知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 重組桿狀病毒BV-cH5/3的構(gòu)建 參閱Genebank上的A/Perth/16/2009(H3N2，GQ293081.1)和A/VietNam/1203/04(H5N1，HM006759.1)HA基因序列，取H5頭部和H3桿部序列合成嵌合HA基因(cH5/3)。去掉信號肽與跨膜區(qū)，在N端引入Gp67信號肽序列，C端引入凝血酶序列、折疊序列和6×His標簽(見圖1)。將cH5/3基因插入pFastBac1構(gòu)建重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)座子(Bacmid)的大腸桿菌DH10Bac。重組質(zhì)粒Bacmid-cH5/3用BamhI和HindⅢ進行雙酶切鑒定。通過M13引物(正向：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′，反向：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至sf9細胞，(28±2)°C培養(yǎng)72 h后收集上清液，即為重組桿狀病毒BV-cH5/3。以重組桿狀病毒核酸為模板，PCR擴增cH5/3基因，送上海生物工程有限公司進行測序。

圖1 cH5/3基因構(gòu)建情況

1.3.2 目的蛋白的表達及純化 將重組桿狀病毒(MOI=1)感染sf9細胞。感染72 h后離心收集上清液，用Ni柱進行蛋白純化。收集洗脫液，測定OD280值。將洗脫液經(jīng)10kD的超濾管濃縮到1 mL，分裝，-80 ℃保存。用BCA蛋白定量試劑盒檢測復性蛋白的濃度，并用Western blot進行特異性鑒定。

1.3.3 抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)的構(gòu)建 取50 μL微球(6.25×105)至偶聯(lián)管中，加100 μL洗液，于磁性分離器上靜置2 min分離磁珠。用80 μL活化緩沖液重懸微球，加入10 μL S-NHS和10 μL EDC室溫避光反應20 min。加入2 μg cH5/3蛋白室溫避光反應2 h，血球計數(shù)板計數(shù)微球，并進行磁珠的偶聯(lián)驗證。取96孔板，設置6個陽性測試孔(His-Tag Rabbit mAb，1 000～0.975 ng/mL)和1個陰性對照孔(Rabbit mAb，1 000 ng/mL)。每孔加入5 000個偶聯(lián)微球和50 μL抗體，室溫震蕩孵育2 h后加入50 μL二抗，繼續(xù)孵育30 min。Luminex 200分析微球的熒光信號值。

1.3.4 疫苗接種與樣本收集 所有志愿者根據(jù)標準免疫程序接種四價流感疫苗。在疫苗接種前和接種后第28天采集外周血10mL，分離血漿，-80 ℃保持。

1.3.5 B細胞的體外刺激與培養(yǎng) 采集志愿者外周血50 mL，淋巴細胞分離液分離PBMC，用磁珠分離試劑盒分離B細胞，得到約5×105個目的細胞，加入IL-2(50 ng/mL)、CpG2006ODN(6 μg/mL)和滅活H7N9流感病毒(10 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)6 d，收集細胞培養(yǎng)上清液。

1.3.6 Luminex系統(tǒng)檢測抗H3桿部抗體 于96孔板中加入25 μL cH5/3蛋白包被的彩色微球，再加入25 μL血清(1∶5 000)或上清液，置于旋轉(zhuǎn)搖床上室溫800 rmp孵育2 h，用150 μL洗滌緩沖液洗滌3次，加入PE標記的羊抗人IgG，繼續(xù)孵育2 h，Luminex200分析熒光強度。

1.3.7 間接ELISA法測定血清中的抗H3桿部抗體 將2 μg cH5/3蛋白包被在96孔ELISA板上，4 ℃過夜，0.5%的PBST洗滌5次后，1%BSA，37 ℃封閉2 h，PBST洗滌5次，加入稀釋后的血清，37 ℃孵育1 h。PBST洗滌5次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育1 h，加入顯色劑避光顯色15 min，酶標儀上450 nm進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒Bacmid-cH5/3鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)BamhI和HindⅢ雙酶切，電泳可見4 700 bp左右和1 700 bp兩個條帶，目的基因條帶大小與預期相符(見圖2A)。提取P2代桿狀病毒Bacmind-cH5/3DNA，以cH5/3基因的特異性引物進行PCR擴增，得到一條約為1 700 bp的條帶，與預期一致(見圖2B)。重組桿狀病毒BV-cH5/3經(jīng)測序驗證目的基因序列完全正確。

A：雙酶切鑒定(MW:Marker 10 000; 1:空載體; 2:重組載體)；B：PCR鑒定(MW:Marker 7 000; 1-5:Bacmind-cH5/3質(zhì)粒PCR產(chǎn)物)。圖2 重組質(zhì)粒Bacmid-cH5/3鑒定結(jié)果

2.2 純化蛋白的鑒定 目的蛋白經(jīng)Ni柱純化后進行SDS-PAGE和Western blot鑒定。SDS-PAGE及Western blot結(jié)果均于67.5kD位置顯示唯一條帶(見圖3)，與預期結(jié)果相符，表明目的蛋白表達正確，蛋白的純度及特異性好。

A：SDS-PAGE; B.Western-blot。圖3 純化cH5/3蛋白的鑒定

2.3 包被蛋白濃度和一抗?jié)舛鹊拇_定 分別用2、4、6 μg重組cH5/3蛋白包被相同數(shù)量的磁珠，固定二抗?jié)舛?1 000 ng/mL)，將一抗?jié)舛茸鞅侗认♂?。結(jié)果顯示(見表1)，當?shù)鞍诐舛葹? μg時，MFI值最大，由此確定最佳蛋白包被濃度為2 μg。當cH5/3蛋白量保持不變時，一抗?jié)舛葹? 000 ng/mL時MFI值最大。

表1 CH5/3蛋白包被濃度和一抗?jié)舛却_認

2.4 二抗?jié)舛却_認 當cH5/3蛋白包被濃度為2 μg時，選取1 000 ng/mL和2 000 ng/mL兩個二抗?jié)舛茸鰧Ρ?。結(jié)果顯示，隨著二抗?jié)舛忍岣?，MFI值略有提升，但考慮到二抗?jié)舛仍黾?，非特異性信號值也大大提高，最終采用二抗?jié)舛葹? 000 ng/mL。

表2 Luminex 二抗?jié)舛却_認

2.5 蛋白偶聯(lián)驗證 選擇anti-6×His抗體作為陽性對照，與6×His無關的兔源單克隆抗體為陰性對照。將陽性對照作4倍稀釋(1 000～0.975 ng/mL)，陰性對照濃度為1 000 ng/mL，二抗?jié)舛葹? 000 ng/mL。隨著一抗?jié)舛忍荻认♂?，MFI信號值梯度下降，標準曲線擬合好(R2=0.999 9)，陰性對照信號值很低，證明蛋白與磁珠偶聯(lián)成功，結(jié)果見圖4。

圖4 CH5/3磁珠偶聯(lián)驗證

2.6 Luminex分析血清中抗H3桿部抗體水平 H5亞型流感病毒在人群中的流行率極低。cH5/3蛋白由H5的頭部和H3的桿部構(gòu)成，當Luminex檢測系統(tǒng)檢測到與cH5/3蛋白結(jié)合的抗體，可初步認為即是抗H3桿部抗體。我們采用建立的抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)檢測了13名健康青年志愿者接種疫苗后血清(1∶1 000)中的抗H3桿部抗體，檢測信號用平均熒光值(MFI)表示(見圖5)，大于陰性對照—Capase-3 Rabbit mAb檢測值(MFI=117.5)測視為檢測陽性，結(jié)果表明13名志愿者血清中均能檢測都抗H3桿部抗體。

圖5 外周血抗H3桿部抗體水平

2.7 間接ELISA法測定血清中的抗H3桿部抗體 為了比較抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)和間接ELISA法的敏感性，我們利用間接ELISA法檢測13名青年志愿者血清中的抗H3桿部抗體。同樣采用2μg/mL cH5/3蛋白包被96孔板，將血清稀釋度為1∶1 000的OD值與陰性對照—Capase-3 Rabbit mAb(OD450nm=0.242)相比，結(jié)果表明間接ELISA法僅檢測到2名青年志愿者血清中的抗H3桿部抗體(見圖6)。

圖6 間接ELISA法測定血清中的抗H3桿部抗體

2.8 Luminex與間接ELISA法結(jié)果比較 采用Luminex和間接ELISA法測量13名青年志愿者血清中的抗H3桿部抗體。在血清稀釋比例為1∶1 000的條件下，ELISA法檢測為陽性的血清有2份，Luminex檢測結(jié)果均為陽性。

表3 Luminex與間接ELISA法檢測血清抗H3桿部抗體結(jié)果比較

2.9 Luminex法分析細胞培養(yǎng)上清液中的抗H3桿部抗體水平 外周血B細胞經(jīng)滅活H7N9病毒刺激6 d后，收集上清液采用Luminex系統(tǒng)分析抗H3桿部抗體水平。結(jié)果顯示，疫苗接種后B細胞培養(yǎng)上清中抗cH5/3抗體水平較疫苗接種前的B細胞增高4.24(0.8，26.8)倍，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖7)。

圖7 細胞培養(yǎng)上清中抗H3桿部抗體水平

3 討論

HA是流感病毒表面一種重要的糖蛋白，同時也是病毒中和抗體的主要靶標。HA分為頭部和桿部，頭部抗原位點很容易發(fā)生變異，是流感病毒產(chǎn)生抗原性變異的主要原因[1-2]。頭部抗原性的變異常常導致疫苗的有效性大大降低[3]。HA桿部相對來說比較保守，同一進化組內(nèi)HA桿部抗原性相似。研究證實桿部抗原可以誘導產(chǎn)生交叉反應性抗體[5-6]。然而通常情況下，針對流感病毒HA的抗體應答以頭部為優(yōu)勢，在頭部抗原不存在的情況下，桿部記憶B細胞可以被激活產(chǎn)生交叉反應性抗體[4]。研究報道，流感病毒HA桿部記憶B細胞僅以極低的頻率存在，提示其可能發(fā)揮的免疫保護作用非常有限[7-8]?？沽鞲胁《究贵w常規(guī)檢測方法包括凝集試驗、微量中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附法等，Moody等報道接種季節(jié)性流感疫苗后僅有ELISA法檢測到低水平(1∶200稀釋)的桿部抗體[9]，檢測靈敏度低。為了研究H7N9病毒對HA桿部抗體的誘導作用，本研究建立高敏感性Luminex檢測體系用于抗H3桿部抗體的檢測。

Luminex又稱多功能液相芯片分析系統(tǒng)，是在有色微球、激光技術、應用流體學及高速數(shù)字信號處理技術的基礎上發(fā)展起來的一種多功能液相分析平臺[10-11]。根據(jù)微球內(nèi)部三種熒光的不同比例可區(qū)分500種不同顏色的微球，通過微球共價交聯(lián)抗原，與被測定的抗體結(jié)合以后，加入熒光素標記的二抗，再通過激光掃描熒光編碼來識別單個微球和測量熒光抗體的熒光信號來確定被測分子的濃度。在一次檢測中可完成對多個目標分子的分析，大大減少樣本的消耗量，節(jié)約時間和成本。HA桿部抗原多為構(gòu)象性表位，其抗原性取決于完整的HA空間構(gòu)型。本研究根據(jù)A/VietNam/1203/04H5N1病毒HA頭部和A/Perth/16/2009H3N2病毒HA桿部序列設計cH5/3基因，構(gòu)建重組桿狀病毒BV-cH5/3，并在昆蟲細胞中表達，純化后的cH5/3蛋白偶聯(lián)磁珠建立抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)。蛋白偶聯(lián)驗證試驗結(jié)果證明抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)成功建立。由于H5亞型禽流感病毒較少感染人類，人群中抗H5抗體陽性率極低，因此可以初步認為檢測到的抗cH5/3抗體是針對H3桿部的抗體。

本研究中，我們采用Luminex檢測系統(tǒng)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對所有志愿者接種流感疫苗后的血漿進行了抗H3桿部抗體檢測，Luminex結(jié)果顯示13名志愿者血清中均存在抗H3桿部抗體，但ELISA僅能檢測到2名志愿者體內(nèi)的抗H3桿部抗體，表明Luminex檢測靈敏度顯著高于ELISA法。H3桿部記憶B細胞以極低的頻率存在于外周血中。為了探討流感疫苗接種對HA桿部記憶B細胞二次抗體應答的影響，本研究采用滅活H7N9病毒體外外周血記憶B細胞，細胞培養(yǎng)上清經(jīng)抗cH5/3抗體Luminex檢測系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，無論是疫苗接種前還是疫苗接種后，H7N9在體外均可刺激記憶B細胞產(chǎn)生抗H3桿部抗體。H7N9和H3N2頭部抗原差異大，桿部抗原相似，在缺乏H3頭部抗原的情況下，H7桿部能靶向激活H3桿部記憶B細胞增殖分化為漿細胞，產(chǎn)生抗H3桿部抗體。疫苗接種后細胞培養(yǎng)上清中H3桿部抗體水平增高，表明雖然通常情況下記憶B細胞抗體應答以HA頭部為優(yōu)勢，但疫苗接種后桿部記憶B細胞頻率仍有增高，表明流感疫苗可刺激HA桿部記憶B細胞擴增。

本研究成功建立抗H3桿部抗體Luminex檢測系統(tǒng)，檢測靈敏度高，可用于血清及細胞培養(yǎng)上清中低水平H3桿部抗體的檢測，為進一步研究HA桿部記憶B細胞抗體應答奠定了基礎。采用本建立的Luminex檢測體系證實與H3N2病毒屬于同一進化組的H7N9病毒在體外可刺激H3桿部記憶B產(chǎn)生桿部抗體，且疫苗接種后的B細胞培養(yǎng)上清中H3桿部抗體水平增高，提示疫苗接種后HA桿部記憶B細胞頻率增加。但本研究例數(shù)，需進一步擴大樣本進行驗證。