Villin1啟動(dòng)子調(diào)控miR-7-Sponge真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)小鼠炎癥性腸炎模型的影響

王 亞，趙娟娟，曾文煥，劉依婷，梁 杰，賀 鈺，蒲廷莉，陳世鵬，李冬玫，徐 林

(1.貴州省基因檢測(cè)與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨貴州省生物治療人才基地，貴州 遵義 563099；2.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

隨著生活節(jié)奏的加快，飲食結(jié)構(gòu)的改變，炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)的發(fā)病率不斷攀升，且易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響人類的健康。炎癥性腸病包括克羅恩氏病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)等，是一種病因(包括遺傳學(xué)、環(huán)境、微生物菌群及免疫失衡等)尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其主要特征是黏膜下大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和腸上皮層的損傷[1-2]。因此，深入探討 IBD 內(nèi)源性的發(fā)生調(diào)節(jié)機(jī)制有助于為該疾病的預(yù)防、診斷和治療提供新的策略。

MicroRNA(miRNAs)是進(jìn)化保守的長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)水平[3]。近年來，已發(fā)現(xiàn)許多miRNAs參與IBD的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。如IBD患者腸道炎癥粘膜中miR-301a升高通過下調(diào)SNIP1誘導(dǎo)IL-17和TNF-α的表達(dá)促進(jìn)腸道粘膜炎癥[4]。 CD或UC患者結(jié)腸組織中miR-31的增加，通過降低炎癥細(xì)胞因子受體(Il7R和Il17RA)和信號(hào)蛋白(GP130)的表達(dá)，而減輕小鼠結(jié)腸上皮的炎癥反應(yīng)，同時(shí)通過調(diào)節(jié)WNT和Hippo信號(hào)通路，促進(jìn)損傷后腸上皮細(xì)胞的再生[5]。另外也有研究顯示，過表達(dá)miR-129可抑制泛素E3連接酶FBW7介導(dǎo)的IκBα降解和NF-κB活化改善了TNBS誘導(dǎo)的腸道炎癥和結(jié)腸炎[6]。這些研究有力提示 miRNAs是IBD新的重要調(diào)節(jié)子。

MicroRNA-7(miR-7)作為miRNAs家族成員，不僅在多個(gè)物種中具有高度保守性，且在機(jī)體的多種重要生命過程及疾病進(jìn)程中扮演重要角色，可作為多種疾病診斷治療的靶標(biāo)[7-8]。越來越多的研究表明miR-7在IBD等多種腸組織相關(guān)疾病的發(fā)生中具有重要調(diào)控作用。如Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)通過改變HCT116、LOVO等多種腸系腫瘤細(xì)胞系中miR-7的水平，其可通過作用靶分子YY1抑制腫瘤的發(fā)生；Zeng等[10]的研究也顯示上調(diào)結(jié)腸癌HCT-8和Caco-2細(xì)胞中miR-7水平可抑制腫瘤的增殖和侵襲；重要的是，F(xiàn)asseu等[11]發(fā)現(xiàn)UC或CD患者發(fā)炎的結(jié)腸組織中miR-7的水平明顯上調(diào)，另外也有研究顯示miR-7在活躍期CD患者結(jié)腸組織中明顯低表達(dá)[12]。新近，Guo等[13]研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-7表達(dá)可改善 TNBS誘導(dǎo)IBD模型小鼠的損傷。有意思的是，Nguyen等[12]的研究提示改變腸上皮細(xì)胞中miR-7水平后，通過改變miR-7的靶分子CD98的表達(dá)而影響腸上皮細(xì)胞外基質(zhì)的粘附、增殖和分化，與IBD的發(fā)生密切相關(guān)。由此提示腸上皮細(xì)胞中miR-7的水平與IBD的發(fā)生進(jìn)程密切相關(guān)。因此我們擬通過構(gòu)建小鼠IBD模型，觀察發(fā)現(xiàn)miR-7的表達(dá)及定位，并靶向改變小鼠結(jié)腸組織靶細(xì)胞中miR-7的表達(dá)水平，探討其對(duì)IBD病理損傷的影響。

絨毛蛋白1(Villin1)是一種細(xì)胞骨架蛋白，主要分布在腸絨毛刷狀緣上皮細(xì)胞中，已被證明是一種腸道上皮細(xì)胞特異性肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白[14]。其在腸上皮細(xì)胞中明顯高表達(dá)，已有研究將Villin1啟動(dòng)子作為腸上皮細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控的重要元件[15]。因此，我們利用Villin1作為啟動(dòng)子構(gòu)建調(diào)控miR-7海綿體序列(Sponge)表達(dá)的真核表達(dá)載體，miR-7-Sponge即課題組前期利用miRNAs Sponge(海綿體)技術(shù)合成[16]，通過靶向干預(yù)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-7的表達(dá)，初步探討下調(diào)腸上皮細(xì)胞中miR-7的水平對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型進(jìn)程的可能影響，以期為后續(xù)研究治療炎癥性腸病提供前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器 SPF級(jí)C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠，7～8周齡，購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。質(zhì)粒pGL3-Basic、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；miR-7 Sponge雙鏈寡核苷酸、引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成；限制性內(nèi)切酶KpnI、MluI、XhoI及T4DNA連接酶(Thermo Scientific公司)；基因組DNA提取試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)研究所)；質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN有限公司)；TRIZOL裂解液、SYBR Premix Ex Taq real - time PCR試劑盒(TaKaRa公司)；地高辛標(biāo)記miRNA-7探針(丹麥Exqion公司)；濃縮型正常山羊血清封閉液(博士德生物工程有限公司)； EPCAM(華安生物技術(shù)有限公司)、羊抗兔FITC(Abcam)、山羊抗兔抗地高辛DyLight?594(VECTOR公司)；分析純級(jí)異丙醇、二甲苯、無水乙醇、甲醛、蘇木素/伊紅染色液(重慶川東化工)；S1000TM Thermal cycler PCR儀、C1000TM Thermal cycler real-time PCR儀(Bio-Rad公司)；IX-53倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 熒光原位雜交技術(shù) 取小鼠結(jié)腸組織，4%多聚甲醛溶液固定48 h，然后包埋、切片；烘箱60 ℃，2 h烤片，二甲苯20 min脫蠟處理，梯度乙醇(100%，95%，80%，70%)5 min/每個(gè)濃度。去離子水洗滌5 min×3次。1×檸檬酸鹽緩沖液中加壓蒸煮10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，后室溫冷卻。用純DEPC水沖洗玻片，再放入DEPC洗缸中洗滌5 min×3次。100 μL預(yù)熱的雜交液(變性地高辛標(biāo)記的DNA探針緩沖液)滴加于玻片上，37 ℃孵育箱中30 min，再在每張玻片上滴加混合液(雜交探針液和變性地高辛標(biāo)記的DNA探針緩沖液1∶1均勻混合)，37 ℃過夜。過夜后，洗滌、封閉液封閉，加一抗兔來源EPCAM(1∶500)，37 ℃，2 h。1×PBS洗滌5 min×3次，加二抗山羊抗兔FITC(1∶500)和山羊抗兔抗地高辛DyLight?594(1∶500)，室溫避光孵育2 h。DAPI(1∶1 000)，滴加于玻片上10 min，洗滌，進(jìn)行封片，后熒光顯微鏡掃描分析。

1.2.2 PCR擴(kuò)增Villin1啟動(dòng)子序列 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得Villin1啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物序列：上游5′- TGATGACCTGTCAGCTTCCC -3′，下游5′- GATAAAGCGCCGTTCCACAC -3′。抽提小鼠結(jié)腸組織基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Villin1啟動(dòng)子序列(1799 bp)，PCR條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.2.3 pGL3-Basic-Villin1載體的構(gòu)建及鑒定 將Villin1啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物克隆入pGL3-Basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后提取質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶KpnI酶和MluI酶做雙酶切鑒定后測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒pGL3-Basic-Villin1(p-V)。

1.2.4 p-V-miR-7sp載體的構(gòu)建及鑒定 MiR-7sp雙鏈寡核苷酸由我們課題組前期設(shè)計(jì)合成[16]。用MluI/XhoI酶分別雙酶切pGL3-Basic-Villin1、目的基因miR-7sp，產(chǎn)物過夜連接。連接反應(yīng)體系：10×T4Ligase buffer 2μL，目的基因(MluI+XhoI)1μg，pGL3-Basic-Villin1(MluI+XhoI)1μg，T4DNA Ligase1μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：16℃過夜。轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取克隆搖菌，提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶MluI酶和XhoI酶做雙酶切鑒定，以及用限制性內(nèi)切酶KpnI酶、MluI酶和XhoI酶做三酶切鑒定，酶切、測(cè)序鑒定后大量抽提，重組質(zhì)粒命名為pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(p-V-miR-7sp)。

1.2.5 DSS模型建立與分組 (1)選擇7～8周齡的C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠隨機(jī)分為兩組：①p-Cont組(DSS+p-V，n=5)；②p-V-miR-7sp組(DSS+p-V-miR-7sp，n=5)。(2)將DSS溶于飲用水中，配置成濃度為2%的葡聚糖硫酸鈉溶液，供兩組小鼠自由飲用7 d，3 d水恢復(fù)。(3)建模后第2天，根據(jù)小鼠體重分別按照5 mg/kg量經(jīng)尾部靜脈注射p-V和p-V-miR-7sp，每天對(duì)兩組小鼠進(jìn)行稱重，第10天，斷頸法處死小鼠，觀察兩組小鼠結(jié)腸形態(tài)和長(zhǎng)度，后用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-7的表達(dá) 分別收集兩組小鼠心、肝、腎、結(jié)腸、淋巴結(jié)組織樣本，TRIZOL法提取各樣本RNA。MiR-7、內(nèi)參基因U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件分別按試劑盒說明書操作，Real-time PCR反應(yīng)體系按照2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，PCR Primer 1 μL，ddH2O 7 μL,cDNA 2 μL的比例分別配足20 μL的體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 30 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.7 H&E染色 取目的器官，4%多聚甲醛固定48 h后，石蠟包埋，切片，進(jìn)行H&E染色，然后顯微鏡下觀察其病理結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果

2.1 MiR-7在IBD小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中高表達(dá) 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-7在DSS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠結(jié)腸組織中明顯高表達(dá)且主要定位于結(jié)腸上皮細(xì)胞(EPCAM+細(xì)胞)中(見圖 1)。

2.2 pGL3-Basic-Villin1載體的構(gòu)建及鑒定 以WT小鼠結(jié)腸組織基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Villin1序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在1 799 bp的位置出現(xiàn)目的條帶(見圖 2A)。PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnI酶和MulI酶雙酶切純化后，亞克隆入pGL3-Basic載體中，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑克隆、搖菌后進(jìn)一步提取質(zhì)粒。利用KpnI酶和MulI酶做雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了4 818 bp和1 799 bp左右的兩條帶(見圖 2B)，并通過質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果(見圖 2C)，證明pGL3-Basic-Villin1(p-V)載體成功構(gòu)建。

A：PCR擴(kuò)增Villin1啟動(dòng)子序列；B：p -V重組質(zhì)粒Kpn I/Mul I雙酶切鑒定；C：p -V重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。圖2 PCR擴(kuò)增Villin1的凝膠電泳圖以及p-V重組載體的酶切及測(cè)序結(jié)果

2.3 p-V-miR-7sp載體的構(gòu)建及鑒定 將目的基因miR-7sp與pGL3-Basic-Villin1的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取克隆搖菌，并提取質(zhì)粒。利用MluI酶和XhoI酶做雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了6 617 bp和140 bp左右的兩條帶(見圖 3A-1)。通過KpnI酶、MluI酶和XhoI酶做三酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了4 818 bp、1 799 bp和140 bp左右的三條帶(見圖 3A-2)，并通過質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果(見圖 3B)，證明pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(p-V-miR-7sp)載體構(gòu)建成功。

A:p-V-miR-7sp重組質(zhì)粒 Mlu I/Xho I 雙酶切，Kpn I/Mlu I/Xho I 三酶切鑒定； B:p-V-miR-7sp 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。圖3 p-V-miR-7sp重組質(zhì)粒酶切及測(cè)序結(jié)果鑒定

2.4 p-V-miR-7sp載體對(duì)多個(gè)組織中miR-7表達(dá)的影響 DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型，分別經(jīng)p-Cont和p-V-miR-7sp治療后，取樣觀察IBD小鼠心、肝、腎、結(jié)腸、淋巴結(jié)組織，Real-time PCR 檢測(cè)了各組織中miR-7的相對(duì)表達(dá)水平，如圖4所示，p-V-miR-7sp治療后顯著降低小鼠結(jié)腸組織中miR-7的表達(dá)水平(P<0.05)，而在其他組織中無明顯差異(P>0.05)。

*：與對(duì)照組比較，P<0.05，ns：no significant。圖4 不同組織器官中miR-7的相對(duì)表達(dá)量

2.5 p-V-miR-7sp載體對(duì)IBD小鼠結(jié)腸組織的影響 DSS誘導(dǎo)IBD小鼠模型，分別經(jīng)p-Cont和p-V-miR-7sp治療后，觀察IBD小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度變化：較p-V-miR-7sp組，p-Cont組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，明顯充血、水腫(見圖 5)。

圖5 p-V-miR-7sp載體對(duì)小鼠結(jié)腸形態(tài)和長(zhǎng)度的影響

2.6 p-V-miR-7sp載體對(duì)IBD小鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)的影響 H&E染色結(jié)果顯示，p-Cont組小鼠的結(jié)腸上皮和隱窩的結(jié)構(gòu)明顯破壞，甚至消失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病變達(dá)到粘膜和粘膜下層；而p-V-miR-7sp組，結(jié)腸上皮幾乎完整，隱窩結(jié)構(gòu)被輕微破壞，并且這種作用伴隨著大量的杯狀細(xì)胞增生(見圖 6)。

圖6 H&E法檢測(cè)p-V-miR-7sp載體干預(yù)后模型小鼠結(jié)腸組織的病理結(jié)構(gòu)變化

3 討論

越來越多的研究證明，miRNAs作為許多生物學(xué)過程中的關(guān)鍵分子參與調(diào)控生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過程和一系列的生命活動(dòng)，并可作為潛在預(yù)防、診斷、治療的新靶標(biāo)[17-18]。miR-7作為miRNAs家族成員，在機(jī)體的多種重要生命過程及疾病進(jìn)程中扮演重要角色。目前大量的研究主要集中在腫瘤生物學(xué)方面，如miR-7可通過多種不同靶基因調(diào)控肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌等[19-23]的發(fā)生進(jìn)程，這些研究顯示 miR-7可作為多種腫瘤診斷、治療及預(yù)后的重要靶標(biāo)。近年來，多研究表明miR-7在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、功能及免疫相關(guān)疾病的發(fā)生中具有重要調(diào)控角色。如Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-7可介導(dǎo)的PTEN/AKT信號(hào)通路促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化和自發(fā)生發(fā)中心形成，促進(jìn)紅斑狼瘡的發(fā)展；Deng等[25]報(bào)道通過下調(diào)膿毒癥患者血漿中提取的外泌體中miR-7的水平可抑制T淋巴細(xì)胞凋亡而降低死亡率；我們的系列研究也顯示miR-7可調(diào)控多種炎癥疾病的發(fā)生進(jìn)程，如自身免疫性肝炎[26]、腦組織炎癥[7]、肺組織炎性損傷[27]等，這些研究提示miR-7在炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生中具有重要作用。重要的是新近研究發(fā)現(xiàn)miR-7在IBD病變組織中高表達(dá)且水平改變后可明顯影響IBD的發(fā)生進(jìn)程，如：Guo等[28]研究發(fā)現(xiàn)IBD患兒組織中miR-7表達(dá)增加，且與三葉因子3(TFF3)蛋白表達(dá)負(fù)相關(guān)；Yu等[29]研究表明miR-7抑制物可調(diào)控RNF183，下調(diào)IκBα的泛素化和降解從而減輕腸道炎癥的進(jìn)程。這些研究顯示miR-7在炎癥性腸炎的發(fā)生進(jìn)展中具有重要調(diào)控角色。

在本研究中，我們首先通過熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)IBD模型小鼠結(jié)腸組織中miR-7的水平，發(fā)現(xiàn)miR-7在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平明顯增高，重要的是且主要定位于結(jié)腸上皮細(xì)胞中，提示結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-7的水平改變與IBD的發(fā)生密切相關(guān)。為了靶向下調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-7的水平，我們構(gòu)建了由結(jié)腸上皮細(xì)胞中明顯高表達(dá)的基因Villin1為啟動(dòng)子調(diào)控的miR-7 Sponge(sp)真核表達(dá)載體，通過尾部靜脈注射觀察干預(yù)結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-7后對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD病理損傷的影響。首先以WT小鼠結(jié)腸上皮組織基因組DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增基因Villin1啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnI酶和MluI酶雙酶切后克隆入pGL3-Basic載體，克隆產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、酶切和測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建pGL3-Basic-Villin1載體，然后將化學(xué)合成的干擾miR-7表達(dá)的miR-7sp序列，經(jīng)MluI酶和XhoI酶雙酶切，克隆入pGL3-Basic-Villin1載體，克隆產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、雙酶切和三酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pGL3-Villin1-miR-7-Sponge(命名為p-V-miR-7sp)。許多證據(jù)證明miR-Sponge是體內(nèi)不同miRNAs分子功能喪失的有效策略[30]。而我們的前期數(shù)據(jù)表明，miR-7-Sponge可以有效抑制肺、脾、腦、肝臟等在內(nèi)的小鼠多個(gè)器官中的miR-7表達(dá)[27]。重要的是，我們將miR-7-Sponge構(gòu)建到含有結(jié)腸上皮細(xì)胞特異高表達(dá)基因Villin1啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體上，通過尾部靜脈注射到DSS誘導(dǎo)的IBD模型小鼠中，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠結(jié)腸組織中miR-7的表達(dá)水平顯著降低，而在其他組織中無明顯差異，表明p-V-miR-7sp真核表達(dá)載體可以特異下調(diào)小鼠結(jié)腸上皮組織中miR-7水平。重要的是，隨著IBD小鼠結(jié)腸上皮組織中miR-7水平的下調(diào)，小鼠結(jié)腸組織充血、水腫減輕，伴隨較長(zhǎng)的結(jié)腸長(zhǎng)度，隱窩結(jié)構(gòu)輕微破壞，炎癥癥狀顯著減輕，這些結(jié)果提示基于Villin1啟動(dòng)子調(diào)控的miR-7sp真核表達(dá)載體不僅可有效靶向下調(diào)結(jié)腸上皮組織中miR-7的表達(dá)水平并且可顯著減輕IBD的病理損傷。

然而，IBD發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，是由遺傳因素，免疫系統(tǒng)和環(huán)境(包括腸道微生物群)之間復(fù)雜相互作用的結(jié)果[1]。目前我們觀察到的p-V-miR-7sp真核表達(dá)載體可顯著改善IBD的病理損傷，然而涉及免疫系統(tǒng)及靶分子的具體調(diào)節(jié)機(jī)制需要進(jìn)一步深入探討。另外已有的研究證明miRNAs參與腸道菌群的選擇及其穩(wěn)態(tài)的維持[31]，但miR-7是否通過菌群調(diào)節(jié)進(jìn)而影響腸道免疫反應(yīng)仍待進(jìn)一步明確。此外，雖然目前在臨床IBD治療中所應(yīng)用的藥物(例如硫嘌呤或抗TNF)治療是有效的，但產(chǎn)生的副作用明顯，如用于IBD治療的大多數(shù)藥物在免疫抑制期間都可能引起肝臟毒性，以致多達(dá)三分之一的患者對(duì)這些療法難以忍受[32]。也有研究顯示促炎途徑如IL-12/ IL-23軸，IL-6途徑或Janus激酶抑制劑的新型療法以及其它調(diào)節(jié)抗炎信號(hào)通路的方法正在探索中[33]。因此，盡快闡明IBD新的干預(yù)策略對(duì)于IBD的臨床治療具有重要意義。針對(duì)我們的研究，亟待進(jìn)一步闡明Villin1調(diào)控miR-7sp載體干預(yù)IBD病理損傷所涉及的抗炎相關(guān)信號(hào)通路，并完善其安全性及靶向性相關(guān)工作。

總之，在本研究中我們不僅成功構(gòu)建了結(jié)腸上皮細(xì)胞特異基因Villin1啟動(dòng)子調(diào)控的miR-7干擾序列miR-7sp真核表達(dá)載體，而且初步發(fā)現(xiàn)該載體的干預(yù)應(yīng)用可較好的改善IBD的病理損傷，這為后續(xù)開發(fā)基于miR-7靶向基因治療腸組織相關(guān)疾病的新策略提供重要的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。