小檗堿通過上調(diào)miR-137抑制APP表達調(diào)控阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展

周景芬 張開 張林英 張煒琦 羅娜 孫洪

(武漢市第一醫(yī)院 1老年病科，湖北 武漢 430022；2皮膚科；3老年醫(yī)學(xué)科)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于中老年人群，其以記憶力減退及認知功能缺失為主要臨床表現(xiàn)〔1〕。既往研究顯示β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積在AD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，促進淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)水解成Aβ造成Aβ異常沉積從而引起腦部組織炎癥反應(yīng)最終造成腦組織萎縮及神經(jīng)元丟失等癥狀〔2〕。因而抑制APP蛋白表達可延緩AD發(fā)生發(fā)展。

研究表明小檗堿(BBR)可減少Aβ蛋白累積從而改善AD小鼠的癡呆癥狀，并可有效保護神經(jīng)細胞〔3〕。但BBR在AD發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未完全闡明。研究〔4，5〕預(yù)測顯示微小RNA-137(miR-137)可能是APP上游調(diào)控基因，研究表明上調(diào)miR-137的表達可影響腫瘤細胞的增殖及凋亡，還可通過調(diào)控其下游分子絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶表達而延緩Aβ沉積。miR-137在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性細胞中低表達，并可在AD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用〔6，7〕。本研究旨在探討B(tài)BR對人Aβ25～35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞增殖及凋亡的影響，分析其對miR-137/APP的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 BBR購自湖北裕興化工制藥有限公司；Aβ25～35干粉購自美國GenScript公司；人SK-N-SH神經(jīng)細胞瘤細胞購自美國ATCC細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自上海江林生物科技有限公司；噻唑藍(MTT)購自北京百奧萊博科技有限公司；凋亡試劑盒購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；雙熒光素酶報告基因載體及活性檢測試劑盒均購自美國Promega公司；miR-137模擬物(mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-con)、miR-137特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-137)及其陰性對照(anti-miR-con)均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人細胞周期蛋白(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase-3)抗體購自美國Abcam公司；兔抗人APP多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實驗分組 SK-N-SH細胞放入含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用20 μmol/L的Aβ25～35處理SK-N-SH細胞建立AD模型〔8〕。實驗設(shè)置分組：NC組(未經(jīng)Aβ25～35誘導(dǎo)SK-N-SH細胞)、Aβ25～35組(Aβ25～35處理SK-N-SH細胞24 h)、10 μmol/L BBR組(含有20 μmol/L的Aβ25～35與10 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)、20 μmol/L BBR組(含有20 μmol/L的Aβ25～35與20 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)、40 μmol/L BBR組(含有20 μmol/L的Aβ25～35與40 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)、80 μmol/L BBR組(含有20 μmol/L的Aβ25～35與80 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)。采用MTT法檢測各組SK-N-SH細胞存活率及凋亡率，篩選適宜濃度進行后續(xù)研究。為探究miR-137表達變化對Aβ25～35誘導(dǎo)SK-N-SH細胞存活及凋亡的影響，實驗設(shè)置分組：Aβ25～35+miR-con組(miR-con轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)、Aβ25～35+miR-137組(miR-137 mimics轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)。分析miR-137對APP的靶向調(diào)控作用，實驗分組：miR-con組(miR-con轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h)、miR-137組(miR-137 mimics轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h)、anti-miR-con組(anti-miR-con轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h)、anti-miR-137組(anti-miR-137轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h)。后續(xù)實驗驗證黃連素是否調(diào)控miR-137/APP表達而發(fā)揮作用，實驗分組：Aβ25～35+BBR+anti-miR-con組(anti-miR-con轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35與40 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)、Aβ25～35+BBR+anti-miR-137組(anti-miR-137轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞48 h，含有20 μmol/L的Aβ25～35與40 μmol/L BBR的培養(yǎng)液培養(yǎng)SK-N-SH細胞24 h)。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 收集對數(shù)生長期SK-N-SH細胞5×104個/ml，取100 μl細胞懸液接種于96孔板，按照1.2.1設(shè)置分組后，每個處理設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻，應(yīng)用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔光密度值(OD)值。細胞存活率(%)=〔(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常培養(yǎng)組OD值-空白對照OD值)〕×100%。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組SK-N-SH細胞，0.25%胰蛋白酶消化，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min(4℃，離心半徑6 cm)，收集細胞沉淀，加入500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μl PI，充分混勻，室溫避光孵育20 min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4qRT-PCR檢測細胞中miR-137表達水平 采用Trizol法提取SK-N-SH細胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計測定RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O補足體系至20 μl。miR-137以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-137相對表達量。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測 Starbase預(yù)測顯示miR-137與APP的3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，構(gòu)建含有miR-137結(jié)合位點的APP-3′UTR野生型(WT-APP)及突變型(MUT-APP)報告基因載體，在AD模型細胞中轉(zhuǎn)染miR-137和APP野生型及突變型報告基因載體，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值)。

1.2.6Western印跡檢測CyclinD1、cleaved-caspase-3、APP蛋白表達 收集各組SK-N-SH細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，取30 μg蛋白上樣量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃孵育過夜，加入蛋白一抗(1∶1 000)，TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1BBR對SK-N-SH細胞的增殖的影響 與NC組存活率〔(100±10.22)%〕比較，Aβ25～35組〔(55.32±5.85)%〕SK-N-SH細胞存活率顯著降低(P<0.05)；相較于Aβ25～35組，10、20、40、80 μmol/L BBR組SK-N-SH細胞存活率顯著升高〔(60.22±6.23)%、(73.96±7.10)%、(90.35±9.05)%、(91.22±9.12)%，P<0.05〕，其中20 μmol/L BBR組、40 μmol/L BBR組SK-N-SH細胞存活率相對較高，因而選用20、40 μmol/L BBR組進行后續(xù)研究。

2.2BBR對SK-N-SH細胞凋亡的影響 與NC組相比，Aβ25～35組SK-N-SH細胞凋亡率與cleaved-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；相較于Aβ25～35組，20 μmol/L BBR組、40 μmol/L BBR組SK-N-SH細胞凋亡率與cleaved-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖1、表1。

A:流式細胞儀檢測細胞凋亡;B:Western印跡檢測cleaved-caspase-3蛋白表達;1～4:NC組、Aβ25～35組、20 μmol/L BBR組、40 μmol/L BBR組圖1 不同濃度BBR對SK-N-SH細胞凋亡的影響

表1 不同濃度BBR對SK-N-SH細胞凋亡的影響

2.3BBR對miR-137表達的影響 與NC組(1.00±0.12)相比，Aβ25～35組SK-N-SH細胞中miR-137的表達水平顯著降低(0.35±0.03，P<0.05)；與Aβ25～35組比較，20 μmol/L BBR組、40 μmol/L BBR組SK-N-SH細胞中miR-137的表達水平均顯著升高(0.66±0.08，0.90±0.09，均P<0.05)。

2.4miR-137過表達對SK-N-SH細胞活力和凋亡的影響 與Aβ25～35+miR-con組相比，Aβ25～35+miR-137組SK-N-SH細胞存活率和CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖2、表2。

1～4：NC組、Aβ25～35組、Aβ25～35+miR-con組、Aβ25～35+miR-137組圖2 Western印跡檢測CyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達

表2 miR-137過表達對SK-N-SH細胞活力和凋亡的影響

2.5miR-137靶向調(diào)控APP的表達 Starbase對miR-137和APP結(jié)合位點進行預(yù)測，見圖3A；miR-137組(WT-APP)熒光素酶活性顯著低于miR-con組(1.00±0.11，P<0.05)；miR-137組APP水平(0.45±0.05)顯著低于miR-con組(1.25±0.13)，anti-miR-137組APP水平(1.86±0.20)顯著低于anti-miR-con組(1.28±0.12，均P<0.05)，見圖3B。

2.6低表達miR-137通過負向調(diào)控APP表達逆轉(zhuǎn)BBR對SK-N-SH細胞活力和凋亡的影響 與Aβ25～35+BBR+anti-miR-con組比較，Aβ25～35+BBR+anti-miR-137組SK-N-SH細胞存活率和CyclinD1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表3。

A：生物信息軟件預(yù)測miR-137與APP靶向關(guān)系；B：Western印跡檢測APP蛋白表達量圖3 miR-137靶向APP，調(diào)控APP表達

1～4：Aβ25～35組、Aβ25～35+BBR組、Aβ25～35+BBR+anti-miR-con組、Aβ25～35+BBR+anti-miR-137組圖4 Western印跡檢測APP、CyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 低表達miR-137通過負向調(diào)控APP表達逆轉(zhuǎn)黃連素對SK-N-SH細胞活力和凋亡的影響

3 討 論

AD發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激及神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)，研究表明Aβ可促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，促進神經(jīng)元細胞變性及死亡〔9，10〕。目前AD治療藥物的作用機制尚未完全闡明，因而深入研究藥物抗AD的分子機制對AD的防治具有重要意義。BBR主要從中草藥黃連中提取，研究表明BBR可通過抑制JNK信號通路激活從而緩解Aβ1～42誘導(dǎo)的細胞凋亡〔11〕。研究表明BBR可通過抗神經(jīng)炎癥、抗凋亡等多種機制從而保護神經(jīng)系統(tǒng)〔12〕。相關(guān)報道指出BBR可通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的表達從而保護自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)功能〔13〕。本研究結(jié)果提示BBR對Aβ25～35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞存活具有促進作用；BBR對Aβ25～35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞凋亡具有抑制作用。細胞凋亡過程涉及多種致凋亡因子，caspase-3是細胞凋亡過程中的執(zhí)行分子，正常生理條件下，caspase-3以酶原的形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)，細胞受到凋亡信號時，caspase-3被激活后形成有活性的片段從而誘導(dǎo)細胞凋亡，研究表明抑制caspase-3的活化可抑制細胞凋亡〔14〕。本研究結(jié)果提示BBR可能通過下調(diào)cleaved-caspase-3的表達而抑制AD模型細胞凋亡。

miRNA可通過調(diào)控下游靶基因表達從而參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程，研究表明miR-137可參與AD等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生過程〔15，16〕。相關(guān)報道指出miR-137可通過調(diào)控神經(jīng)酰胺/Aβ通路進而發(fā)揮抗AD的作用〔17〕。與上述研究報道相似，本研究結(jié)果BBR可能通過上調(diào)miR-137的表達從而發(fā)揮抗AD的作用；miR-137過表達可通過調(diào)控細胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白的表達從而對Aβ25～35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞發(fā)揮保護作用。本研究證實APP是miR-137的靶基因，miR-137可靶向調(diào)控APP的表達，研究表明抑制APP的表達可保護神經(jīng)細胞，并可提高小鼠認知及記憶能力〔18，19〕。為證實BBR是否通過調(diào)控miR-137、APP的表達從而保護AD模型神經(jīng)細胞，本研究結(jié)果提示BBR可通過上調(diào)miR-137的表達及下調(diào)APP的表達從而保護AD模型神經(jīng)細胞。

綜上，BBR可抑制Aβ25～35誘導(dǎo)的SK-N-SH細胞凋亡，其作用機制可能是上調(diào)miR-137的表達及抑制APP的表達而發(fā)揮作用，可為治療AD相關(guān)新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。但仍需進行體內(nèi)實驗進一步驗證BBR抗AD的藥效及其可能的作用機制。