老年骨質(zhì)疏松患者血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性

劉菊 雷映紅 陳輝 戴朝博 王志剛 趙晟珣 李琳

(武漢市第一醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430022)

骨質(zhì)疏松(OP)是一種以骨量減低，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特點(diǎn)的全身性骨病。OP性骨折(OF)是OP的嚴(yán)重后果，也是老年人致殘、致死的主要原因之一。OP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果〔1〕。OP受到多方面因素的影響,其中遺傳因素占重要作用〔2〕。Klotho基因是與各種衰老表型相關(guān)的基因〔3〕。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，klotho 基因 G395A 位點(diǎn)AA基因型可能是老年男性O(shè)P患者的致病基因〔4〕。本研究旨在探討老年OP患者血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A 基因多態(tài)性與OP的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 本研究隨機(jī)納入2018年1月至12月于武漢市第一醫(yī)院老年病科住院的非OP老年患者50例為非OP組(非OP組)，OP非骨折的患者50例為OP組(OP組)，同期在武漢市第一醫(yī)院骨科住院的OP的老年患者50例為OP組(OF組)，入選對(duì)象均為髖部骨折?；颊吣挲g均≥70歲，均排除嚴(yán)重心、腦、肝腎損害，各種惡性腫瘤、急性感染性疾病、手術(shù)、其他應(yīng)激情況及近期服用影響骨代謝的藥物或患有影響骨代謝的疾病的患者。

1.2方法

1.2.1臨床資料 人體參數(shù)測(cè)量，包括體重、身高，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)：體重(kg)/身高(m)2。研究對(duì)象空腹、穿單衣、脫鞋去帽，采用統(tǒng)一的工具檢測(cè)。測(cè)量收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)，采集空腹8 h以上的肘靜脈血，用全自動(dòng)生化儀(型號(hào):Chemray 240，深圳雷杜生命科技公司)檢測(cè)糖化血紅蛋白(HBA1c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等指標(biāo)。運(yùn)用ELISIA試劑盒(貨號(hào)：ZC-31968，zcibio)檢測(cè)血清Klotho蛋白水平。采用雙能X線骨密度(BMD)測(cè)定儀，測(cè)定髖部T值(T-score)。

1.2.2Klotho基因啟動(dòng)子G395-A 單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè) 用 Taqman 等位基因特異性雜交分析進(jìn)行SNP分型。采外周靜脈血2 ml,3.2%檸檬酸鈉抗凝,分離血漿和白細(xì)胞,以經(jīng)典酚-氯仿法提取白細(xì)胞基因組,-70℃保存。

根據(jù)GENEBANK的KLOTHO基因全DNA序列設(shè)計(jì)引物，并由武漢谷歌生物科技有限公司合成。預(yù)計(jì)G-395A擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為389 bp，上游引物為:TAGGGCCCGGCAGGAT，下游引物為：CCTGGAG-CGGCTTCGTC，F(xiàn)AM 標(biāo)記探 A:CCCCAAGT-CGGGAAAAGTTGGTC，HEX 標(biāo)記探針G:CCC-CCAAGTCGGGGAAAGTTGGTC。G-395A的PCR體系：總體積20 μl，上下游引物的濃度均為0.8 μmol/L，探針A和G的終濃度分別為75 nmol/L和250 nmol/L，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃ 1 min、65℃ 30 s、72℃ 48 s 共40個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃ 5 min，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3診斷標(biāo)準(zhǔn) OP的診斷采用WHO(1994年)的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕：T值評(píng)分，T>-1為骨量正常，-1≤T≤-2.5為骨量減少，T<-2.5為OP，T<-2.5且伴有1處或1處以上骨折為嚴(yán)重OP。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析及非條件Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料的比較 各組年齡比較，OP組與非OP組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而OF組明顯高于非OP組和OP組(P<0.05)；OF組男性比例明顯少于非OP組(P<0.05)，OP組和OF組BMI和LDL-C、Klotho蛋白水平較非OP組均明顯偏高(P<0.05)；OP組和OF組HBA1c較非OP組均明顯偏高(P<0.05)，OF組較OP組明顯偏高(P<0.05)；各組間SBP和DBP比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≥0.05)；OP組和OF組BMD較非OP組均明顯偏低(P<0.05)，OF組較OP組明顯偏低(P<0.05)。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2Klotho G395-A 基因位點(diǎn)分布比較 OP組和OF組AA基因型及A等位基因頻率較非OP組均明顯升高(P<0.05)；OF組AA基因頻率較OP組明顯升高(P<0.05)，而A等位基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；3組間AG、GG基因型及G等位基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

表2 Klotho G395-A基因位點(diǎn)分布比較〔n(%),n=50〕

2.3Klotho蛋白水平、G395-A基因多態(tài)性與OF的相關(guān)性分析 選擇年齡、性別、BMI、收縮壓、舒張壓、HBA1c、LDL-C、 BMD、血清Klotho蛋白水平及Klotho G395-A基因型等因素與OF進(jìn)行相關(guān)分析，顯示OF與年齡、性別、HBA1c及AA基因型頻率呈正相關(guān)(r=0.159、0.099、0.248、0.389，均P<0.05)，與BMD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.209，P<0.05)；通過回歸分析校正混雜因素后，年齡、BMD、AA基因型頻率為OF的獨(dú)立相關(guān)因素(OR=1.17、1.43、1.04，均P<0.05)。

3 討 論

OP是絕經(jīng)后女性和老年人常見病、多發(fā)性疾病，是一種與增齡有關(guān)的骨骼疾病。老年骨質(zhì)疏松(SOP)是70歲以后發(fā)生的OP，據(jù)調(diào)查顯示，我國(guó)65歲以上人群OP患病率達(dá)到32.0%，其中男性為10.7%，女性為51.6%，城市地區(qū)為25.6%，農(nóng)村地區(qū)為35.3 %〔6〕。OF是OP的嚴(yán)重階段，具有發(fā)病率及致殘致死率高、醫(yī)療花費(fèi)高等特點(diǎn)〔7〕。

OF危險(xiǎn)因素眾多。BMD減少是OF最重要的危險(xiǎn)因素。而種族、年齡、性別、吸煙、低體重指數(shù)、缺乏運(yùn)動(dòng)、跌倒、絕經(jīng)年齡、脆性骨折史和骨折家族史、藥物影響(如免疫抑制劑、干擾代謝的藥物、抗抑郁藥、抗凝藥、安眠藥等)等均為OF重要的危險(xiǎn)因素〔8〕。OP發(fā)病機(jī)制遺傳因素占46%～62%，而后天因素占38%～54%〔9〕。Klotho基因是與壽命和各種衰老表型相關(guān)的基因，研究發(fā)現(xiàn)Klotho基因與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腎損傷、OP等相關(guān)〔10,11〕。本課題組前期研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，klotho G395-A基因多態(tài)性與老年男性骨質(zhì)疏松發(fā)病有關(guān)，AA基因型可能是老年骨質(zhì)疏松的致病基因。

在不同人群其klotho基因單核苷酸多態(tài)性與骨密度有相關(guān)性，提示原發(fā)性O(shè)P的發(fā)生、發(fā)展可能與klotho基因表達(dá)異常有關(guān)。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，klotho G-395A 基因型與絕經(jīng)狀態(tài)相關(guān)，絕經(jīng)后女性GG基因型的BMD明顯低于AA基因型，但在絕經(jīng)前卻無顯著關(guān)聯(lián)，提示在絕經(jīng)后女性中klotho G-395A基因型是引發(fā)OP的易感基因。西班牙的一項(xiàng)研究〔13〕發(fā)現(xiàn)，在年齡33歲的中、青年人群中,FV+W基因型攜帶者的BMD明顯高于FF基因型,證實(shí)了klotho基因多態(tài)性是影響B(tài)MD的遺傳因素之一。田小春等〔14〕研究klotho G-395A 基因多態(tài)性與原發(fā)性O(shè)P的相關(guān)性過程中，還發(fā)現(xiàn)klotho G-395A 基因AA 等位基因型與男性老年人OP相關(guān)。

綜上，klotho G395-A基因多態(tài)性與老年OF有相關(guān)性，AA基因型可能是老年OF的易感基因，本研究為老年OF的防治提供理論基礎(chǔ)。