miR-320a與VEGF在肺癌血清中表達(dá)及其臨床意義

劉亞群 王布 孔文杰 張秀瓏 張志華

(河北北方學(xué)院 1附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000；2研究生部)

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2018年公布的資料顯示，肺癌是世界上最常見(jiàn)和最致命的惡性腫瘤之一，僅2018年一年就新增1 810萬(wàn)病例，死亡人數(shù)高達(dá)960萬(wàn)，5年生存率僅為15.8%,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者約占所有肺癌總數(shù)的80%，超過(guò)50%的肺癌患者被診斷出NSCLC有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，整體預(yù)后差，約2/3的患者確診時(shí)已無(wú)手術(shù)機(jī)會(huì)〔1〕。要改善肺癌患者生存率，需要依靠規(guī)范有序的診斷、分期及根據(jù)其臨床行為制訂多學(xué)科治療方案。隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步和人類的探索發(fā)現(xiàn)：微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性小分子單鏈RNA，由19～24個(gè)核苷酸組成〔2〕。研究人員發(fā)現(xiàn)miR-320a在肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病關(guān)系密切〔3〕。關(guān)于miR-320a與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與肺癌發(fā)病關(guān)系，目前相關(guān)研究文獻(xiàn)較少。本研究旨在探討肺癌患者血清中miR-320a與VEGF的表達(dá)關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本收集 2017年9月至2019年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院入院患者中通過(guò)胸腔鏡活檢、電子支氣管鏡、肺穿刺活檢確診肺癌患者93例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)制定的肺癌臨床診斷；②預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月，體能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(ECOG-PS)評(píng)分為0～2分；③經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診，且經(jīng)CT檢查證實(shí)至少存在1處可測(cè)量病灶；④心肝腎等重要臟器功能無(wú)重大損傷，功能基本正常，無(wú)嚴(yán)重感染；⑤骨髓儲(chǔ)備正常；排除標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)計(jì)生存期<3個(gè)月；②心肝腎等重要臟器功能存在嚴(yán)重障礙者，合并未控制的嚴(yán)重感染；③未找到可供測(cè)量的或評(píng)價(jià)的實(shí)體瘤；④骨髓造血功能異常；年齡46～78歲，并于同期收集93例健康體檢者設(shè)為正常健康組。本實(shí)驗(yàn)研究均經(jīng)過(guò)患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)血清miR-320a表達(dá)量 入院病人于清晨6點(diǎn)空腹抽取靜脈血4 ml，所取標(biāo)本立即于離心機(jī)以3 500 r/min離心5 min，分離上層血漿并保存于-80℃冰箱。按cDNA合成試劑盒(購(gòu)自北京天根生化科技公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件:42℃ 60 min;95℃ 3 min;產(chǎn)物cDNA置于-20℃冰箱保存。以cel-miR-39為外參。miR-320a的逆轉(zhuǎn)錄引物的正向引物(5′-3′)為 TATTCGCACTGGATACGACTCCAGC，反向引物 (5′-3′) 為 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG。外參引物購(gòu)自天根生化(目錄號(hào)：CD200-01)。每組各取200 μl血清，采用天根DP501柱提法提取血清中小于200 nt RNA，TGem微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度和濃度。采用定量PCR試劑盒FP411進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min,94℃ 20 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，5個(gè)循環(huán)；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-320a相對(duì)表達(dá)量。

1.3血清中VEGF檢測(cè) 入院病人于清晨6點(diǎn)空腹抽取靜脈血4 ml，所取標(biāo)本立即于離心機(jī)以3 500 r/min離心5 min，分離上層血漿并保存于-80℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中VEGF，其中VEGF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司；使用由美國(guó)Molecular Devices生產(chǎn)的酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定OD值，并應(yīng)用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的濃度值，測(cè)定方法嚴(yán)格按照人VEGF ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、Pearson相關(guān)分析，采用受試者工作特征曲線面積(AUC)評(píng)估血清miR-320a、VEGF對(duì)肺癌診斷的靈敏度及特異度。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清中miR-320a與VEGF表達(dá) 肺癌組血清中miR-320a表達(dá)濃度顯著低于正常健康組。VEGF肺癌血清中表達(dá)顯著高于正常健康組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 肺癌組和正常組血清miR-320a、VEGF濃度

2.2肺癌患者血清中miR-320a、VEGF表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系 肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達(dá)與TNM分期、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌胚抗原(CEA)高低均有關(guān)(P均<0.05)。肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達(dá)與患者性別、腫瘤病理類型、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 肺癌患者血清中miR-320a表達(dá)、VEGF水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3肺癌患者血清中miR-320a與VEGF相關(guān)性 肺癌患者血清中miR-320a與VEGF呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.753，P<0.05)。

2.4血清中miR-320a、VEGF對(duì)肺癌患者的診斷價(jià)值評(píng)價(jià) 根據(jù)肺癌患者血清中miR-320a、VEGF的表達(dá)含量繪制ROC曲線(圖1)，并確定miR-320a、VEGF的診斷界值分別為miR-320a=1.63、VEGF=233.88 pg/ml，為診斷界值。血清miR-320a、VEGF聯(lián)合檢測(cè)對(duì)肺癌的診斷價(jià)值最高，AUC為0.969(95%CI：0.948～0.991)，靈敏度、特異度分別為0.903、0.946。見(jiàn)表3。

圖1 血清中miR-320a、VEGF診斷肺癌的ROC曲線

表3 miR-320a與VEGF對(duì)肺癌的診斷價(jià)值

3 討 論

mirRNA是一種內(nèi)源性小分子單鏈RNA，由19～24個(gè)核苷酸構(gòu)成的。隨著人類的不斷探索，人類對(duì)miRNA的探索取得階段性成果，人類發(fā)現(xiàn)miRNA在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、侵襲力都有不同程度的影響，其次miRNA對(duì)生存及預(yù)后及生存期都有巨大的影響〔4〕。miR-320a是miRNA家族中重要的成員之一，參與多種腫瘤的表達(dá)。miR-320a通過(guò)調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路在腫瘤中的表達(dá)，如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、Wnt、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，從而發(fā)揮促癌或者抑癌的作用〔5〕。有研究報(bào)道m(xù)iR-320a在腫瘤中(如肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌)表達(dá)水平升高或者降低而發(fā)揮癌基因的作用〔6〕。本研究提示miR-320a可能參與了腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及侵襲，對(duì)肺癌的診斷及治療有一定的指導(dǎo)意義。

VEGF又稱為血管通透因子，是一系列參與信號(hào)傳導(dǎo)的糖蛋白，在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管增生,其通過(guò)增加血管通透性，使血管內(nèi)纖維蛋白原等血漿蛋白外滲，纖維蛋白原與血管外滲纖維連接蛋白等多種成分凝結(jié)形成交叉的纖維蛋白凝膠體，為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)，有利于血管生成〔7〕。其次VEGF及其受體在腫瘤組織中的高水平表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后不良有關(guān),這些腫瘤包括星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、頭頸鱗癌、肝癌等〔8〕。腫瘤血管是腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，其不僅向腫瘤組織提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，也向腫瘤宿主輸出大量腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移〔9〕。本研究結(jié)果表明VEGF是肺癌較好的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)肺癌診斷及治療有一定的指導(dǎo)意義。

本研究提示miR-320a與VEGF可能存在負(fù)反饋?zhàn)饔?，同過(guò)共同的傳導(dǎo)通路發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)血管生成，并加速腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲及轉(zhuǎn)移〔10〕。

本研究結(jié)果表明通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)可在很大程度上降低誤診率和漏診率，對(duì)肺癌患者早期診斷提供重要的參考價(jià)值。

綜上，miR-320a與VEGF的聯(lián)合檢測(cè)有望從理論走向臨床應(yīng)用，為腫瘤的病情判斷、早期診斷、治療開(kāi)辟一條新的途徑〔11〕。