聚合酶螺旋反應(yīng)檢測(cè)肺炎克雷伯菌與臨床樣本評(píng)價(jià)

王泉，馬瑞瑛，楊婷，張亞麗，許苗，撒玉玲，陳清波

（新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830049）

肺炎克雷伯菌是一種常見的院內(nèi)感染致病菌，可引起較嚴(yán)重的下呼吸道感染甚至死亡[1-2]，在嬰兒、腫瘤患者等長(zhǎng)期使用抗生素的病人或免疫力較差的老年人中發(fā)病率較高。臨床癥狀與其他院內(nèi)感染細(xì)菌無明顯差異，難以實(shí)現(xiàn)通過臨床癥狀對(duì)該菌的精準(zhǔn)判斷[3]，目前臨床上針對(duì)肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)方法主要是以傳統(tǒng)的培養(yǎng)法結(jié)合生理生化鑒定或使用最新的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，一般需要2 ～3 d，耗時(shí)較長(zhǎng)。其操作的便捷性、時(shí)效性及靈敏度無法滿足臨床上快速精準(zhǔn)診斷的要求[4-5]，因此需要建立一種快速靈敏的檢測(cè)方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌的鑒定。

近年來，一系列分子生物學(xué)技術(shù)也被用來進(jìn)行肺炎克雷伯菌的檢測(cè)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、多重PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等技術(shù)[6-8]。但此類方法需要專業(yè)的技術(shù)人員和精密的溫控設(shè)備，同時(shí)PCR技術(shù)中使用的Taq 酶活性易受到待檢樣本中的抑制物影響而降低甚至失活，造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[9]。近年來發(fā)展的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、聚合酶螺旋反應(yīng)等）是利用BstDNA 聚合酶的作用實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，受待檢樣本中抑制物影響較小而在臨床微生物檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。

聚合酶螺旋反應(yīng)（PolymeraseSpiralReaction，PSR）技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，具有較高的特異性及靈敏度的優(yōu)勢(shì)在病原微生物快速檢測(cè)方面發(fā)展迅速，相關(guān)學(xué)者已成功將PSR 技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌、痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌等致病菌的檢測(cè)。PSR的原理是利用微生物的特異性核酸序列設(shè)計(jì)4 條引物（2 條檢測(cè)引物，2 條加速引物）識(shí)別目標(biāo)基因5個(gè)不同區(qū)域，利用BstDNA 聚合酶的活性及核酸分子在63 ℃處于半解離半平衡狀態(tài)實(shí)現(xiàn)恒溫條件下快速擴(kuò)增DNA 分子。

在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)高速發(fā)展的今天，肺炎克雷伯菌傳統(tǒng)痰培養(yǎng)檢測(cè)法已無法滿足要求。本研究基于肺炎克雷伯菌外膜蛋白一段特異性基因設(shè)計(jì)PSR 反應(yīng)引物，對(duì)引物進(jìn)行篩選，并對(duì)其菌株特異性和最低檢出限進(jìn)行評(píng)價(jià)。于2019 年9—12 月間在新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院（原新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院）連續(xù)收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本，比較PSR基因檢測(cè)及痰培養(yǎng)檢測(cè)兩種方法的差異性，評(píng)價(jià)PSR恒溫檢測(cè)在呼吸道肺炎克雷伯菌感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試劑：DNA 提取液，廣州迪澳生物科技有限公司；BstDNA 聚 合 酶，New England Biolabs；SYTO 9，寶生物工程（大連）有限公司；肺炎克雷伯氏菌核酸測(cè)定試劑盒（熒光PCR法），上海之江生物科技有限公司；血平板、巧克力平板和麥康凱平板，賽默飛公司。

細(xì)菌及來源：金黃色葡萄球菌ATCC11987，大腸埃希氏菌CMCC44102，肺炎鏈球菌CMCC31001，銅綠假單胞菌ATCC9027，鮑曼不動(dòng)桿菌ACCC11038，肺炎克雷伯氏菌ATCC4352，嗜麥芽窄食單胞菌BNCC106909，流感嗜血桿菌CMCC585283，嗜肺軍團(tuán)菌ATCC33152，結(jié)核分枝桿菌BNCC104756，單核增生李斯特菌ATCC19115，創(chuàng)傷弧菌ATCC27562，腸炎沙門氏菌5186，小腸結(jié)炎耶爾森菌ATCC23715，志賀氏菌Q1030，大腸埃希氏菌O157 ATCC700728，蠟樣芽孢桿菌NCTC7997，阪崎腸桿菌ATCC29004，陰溝腸桿菌BNCC353685，均購(gòu)自北納生物科技有限公司。

儀器：QuantStudio?6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI；VIEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

對(duì)肺炎克雷伯氏菌基因通過Blast 比對(duì)獲得特異性片段（KPN_04473，Genebank accession No. CP000647），根據(jù)PSR 反應(yīng)擴(kuò)增原理使用PrimerExplorer 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[10]，設(shè)計(jì)結(jié)果如表1 所示。其中F1、B1 為檢測(cè)引物，IF 及IB 為加速引物。所有引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，其中F1，B1 采用HPLC方式純化，IF 及IB 采用PAGE 方式進(jìn)行純化。

表1 PSR 所用引物序列

1.3 樣本DNA 的制備

對(duì)收集的臨床痰液樣本，在痰樣中加入等體積痰液液化劑（含有N-乙酰-L-半胱氨酸1.0%，乳化劑0.25%，EDTA10 mmol/L）后渦旋震蕩混勻，室溫下放置15 min，吸取1 mL 加入帶旋蓋的離心管中，以10 000 g 轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。隨后加入100 μL 的DNA 提取液并混合均勻，100℃熱裂解10 min。10 000 g 離心2 min，待冷卻至室溫后將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用，其中2 μL 作為核酸擴(kuò)增的模板。

1.4 PSR 反應(yīng)體系

PSR 反應(yīng)體系為25 μL。各組分濃度具體如下：10.0 mmol/L KCl，20.0 mmol/L Tris-HCl，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜堿，10.0 mmol/L（NH4）2SO4，8.0 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U BstDNA 聚合酶，F(xiàn)1 及B1 各1.2 μmol/L，IF 及IB 各0.8 μmol/L，DNA 模板2 μL，SYTO 9 體積為0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。

1.5 菌株特異性評(píng)價(jià)

使用如1.1 描述18 種致病菌對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行驗(yàn)證。按照1.3 中描述使用DNA 提取液對(duì)目標(biāo)菌株及其他菌株的DNA 模板進(jìn)行提取，加入2 μL 的DNA模板至PSR 反應(yīng)體系中，以雙蒸水進(jìn)行對(duì)照，在熒光定量PCR 儀器上于63 ℃反應(yīng)60 min。

1.6 最低檢出限分析

將初始濃度為106CFU/mL的肺炎克雷伯菌的菌懸液采用10 倍稀釋法將其濃度依次稀釋至105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL 和10 CFU/mL。將上述不同濃度的1 mL 菌液樣本以10 000 g 轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液。加入100 μL 的DNA 提取液，100 ℃加熱10 min。10 000 g 離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用，取2 μL 上清液用于核酸擴(kuò)增。在熒光定量PCR 儀器上于63 ℃反應(yīng)60 min，以確定檢測(cè)下限。

1.7 結(jié)果判讀

通過熒光定量PCR儀采集熒光值自動(dòng)計(jì)算Ct值。無Ct值時(shí)，判定為陰性；Ct值≤55 判定為陽(yáng)性；55 ＜Ct值≤60，建議復(fù)核樣本，若Ct值≤55 或仍在此區(qū)間，樣本為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.8 臨床樣本的檢測(cè)

于2019 年9—12 月新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院（原新疆維吾爾自治區(qū)胸科醫(yī)院）連續(xù)收集270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本。采用吸痰或深咳法將痰液樣本留取于痰培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。將涂片革蘭氏染色鏡檢合格的痰液（白細(xì)胞＞25 個(gè)/HP，鱗狀上皮細(xì)胞＜10 個(gè)/HP 為合格，采集痰液樣本均合格）轉(zhuǎn)接至血瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)，隨后使用VIEK 2 COMPACT全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。以鑒定結(jié)果作為最終判讀標(biāo)準(zhǔn)，與PCR 方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，以評(píng)估該方法的臨床適用性及差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

使用上述PSR 體系及引物濃度進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，第1、2、3 和4 套測(cè)定的Ct值分別為19.5、15.3、26.2 和49.6，4 套引物中第2 套引物相對(duì)于其他引物Ct 值小，說明此引物擴(kuò)增效率較高，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌株特異性與最低檢出限實(shí)驗(yàn)

基于PSR 反應(yīng)原理構(gòu)建的恒溫體系擴(kuò)增肺炎克雷伯菌梯度濃度模板時(shí)，在濃度為10 CFU/mL 時(shí)無Ct值，檢測(cè)結(jié)果為陰性；濃度為102CFU/mL 時(shí)，Ct值為30，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說明該反應(yīng)體系最低檢測(cè)濃度為102CFU/mL。使用肺炎克雷伯菌及非目標(biāo)菌株的DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增，18 種特異性菌株均為陰性，且陰性對(duì)照無非特異性擴(kuò)增。綜上所述，所篩選出第2 套引物具有較佳的菌株特異性，最低檢出限為102CFU/mL。

2.3 臨床樣本效果評(píng)價(jià)

從痰培養(yǎng)肺炎克雷伯陽(yáng)性的54 份痰液DNA 模板樣本中，PSR 體系檢出52 份陽(yáng)性，2 份陰性。其中2 份培養(yǎng)陽(yáng)性而PCR 檢測(cè)為陰性可能是由于痰樣本中菌量分布不均，未達(dá)到反應(yīng)體系的最低檢出限，導(dǎo)致其檢測(cè)結(jié)果為陰性。從痰培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為陰性的216 份樣本中，PSR 檢出16 份陽(yáng)性，200 份陰性。將這16 份樣本經(jīng)高保真擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)后均為肺炎克雷伯菌，說明PSR 相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法有更高的敏感度。以痰培養(yǎng)法作為標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度為96.30%，特異度為92.59%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為76.47%，陰性預(yù)測(cè)值為99.01%，總符合率為93.35%（252/270），結(jié)果詳見表2。

表2 以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照評(píng)價(jià)PSR 檢測(cè)的效能表

同商業(yè)化熒光定量PCR 試劑盒相比較，PSR 檢測(cè)的敏感度及特異度分別為100%和96.63%，且兩者一致性較高（Kappa=0.929 5），表明所使用的反應(yīng)體系具有和熒光定量PCR 方法相似的檢測(cè)效能，見表3。

表3 以熒光定量PCR 試劑盒結(jié)果為參照評(píng)價(jià)PSR 檢測(cè)的效能表

3 討論

據(jù)2013 年世界衛(wèi)生組織報(bào)道，由肺炎克雷伯菌引起的腹瀉是導(dǎo)致全球兒童死亡率居高不下的主要原因。同時(shí)，肺炎克雷伯菌的感染率占院內(nèi)細(xì)菌性感染的9.03%，而臨床上普遍采用的痰培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)，可能對(duì)患者的病情造成延誤。

聚合酶螺旋反應(yīng)已實(shí)現(xiàn)對(duì)白色念珠菌和結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。相關(guān)學(xué)者基于rcsA 基因設(shè)計(jì)PSR引物檢測(cè)肺炎克雷伯菌，細(xì)菌基因組最低檢出限為11.5 pg/μL（遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法的檢測(cè)限）[11]，可能會(huì)造成大量的漏檢，無法幫助醫(yī)生對(duì)病因進(jìn)行準(zhǔn)確判斷而延誤治療，不符合現(xiàn)階段精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷的要求。也有學(xué)者利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出限為103～104CFU/mL，同樣高于培養(yǎng)法最低檢出限。造成上述情況的主要原因可能是所選用的靶標(biāo)基因?yàn)閱慰截惢蚧蛞飻U(kuò)增效率較低。本研究所選用的靶標(biāo)基為其特異性較高外膜蛋白基因，屬于多拷貝基因。通過篩選的最優(yōu)引物，最低檢出限可達(dá)到102CFU/mL，優(yōu)于目前大多數(shù)學(xué)者所構(gòu)建的核酸恒溫?cái)U(kuò)增體系，為提高臨床肺炎克雷伯氏菌篩查的陽(yáng)性檢出率提供了可能。

4 結(jié)論

本研究對(duì)270 份疑似呼吸道感染患者的痰液樣本，同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)鑒定、PCR 檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。與痰培養(yǎng)法相比，PSR 檢測(cè)肺炎克雷伯菌感染的敏感度和特異度分別為96.30%及92.59%，具有較高的敏感度及特異度；該方法與傳統(tǒng)痰培養(yǎng)法的Kappa 一致性系數(shù)為0.810，顯示出較高的檢測(cè)性能；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值可分別達(dá)到97.1%（68/70）和99.01%（200/202），表明PSR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者肺炎克雷伯菌感染的概率極高，檢測(cè)結(jié)果為陰性者感染肺炎克雷伯菌概率極低，故PSR 適合于臨床樣本肺炎克雷伯氏菌初篩。同商業(yè)化熒光定量PCR 試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比較，PSR 仍可從熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果陰性樣本篩查出部分陽(yáng)性結(jié)果，說明該方法比所使用商業(yè)化試劑盒具有更高靈敏度。

本研究所使用的PSR 檢測(cè)體系從上樣到報(bào)告結(jié)果耗時(shí)小于1 h，且不需要精密的溫控設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)和偏遠(yuǎn)地區(qū)基層單位的推廣應(yīng)用，為臨床醫(yī)生對(duì)呼吸道疾病診斷提供快速有效的科學(xué)依據(jù)。但隨著廣譜抗菌素的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對(duì)常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現(xiàn)出多重耐藥性，本方法無法確定所篩查細(xì)菌是否具有耐藥性，只能做定性分析。面臨如此嚴(yán)峻的形勢(shì)，一種快捷精準(zhǔn)的診斷方法對(duì)相關(guān)病癥的用藥治療意義重大，期待在未來能夠開發(fā)基于PSR 技術(shù)的肺炎克雷伯菌耐藥篩查核酸檢測(cè)試劑盒。