電針心包經(jīng)穴對急性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)生長抑制信號通路關(guān)鍵分子基因表達(dá)的影響

肖豆,謝崢嶸,唐雅妮,潘江,曹越,婁必丹,章薇,陳成

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長沙 410007）

腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）功能的修復(fù)是醫(yī)學(xué)界的重大難題[1]。臨床研究表明針灸在腦缺血及相關(guān)疾病的臨床治療中不僅能改善患者神經(jīng)功能[2-3],還能調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞因子[4-5]。前期研究[6-8]表明電針心包經(jīng)穴能有效抑制腦缺血損傷后心腦組織細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦血管新生、增加大腦中動脈缺血模型大鼠血清、腦組織中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）的表達(dá)、降低血清中神經(jīng)生長抑制因子（nogo protein-A, Nogo-A）含量,但對缺血模型大鼠腦組織中 Nogo-A的表達(dá)研究尚不深入?，F(xiàn)選取天泉、曲澤、內(nèi)關(guān)、大陵4個不同神經(jīng)節(jié)段分布的腧穴代表手厥陰心包經(jīng)整條經(jīng)絡(luò),基于Nogo-A抑制信號通路觀察電針對局灶性腦缺血模型大鼠血清 Nogo-A、Ras同源基因家族成員 A（ras homolog gene family member A, RhoA）、Rho 激酶Ⅱ（rho-associated kinase Ⅱ, ROCKⅡ）及缺血側(cè)腦組織中Nogo-A、NgR1、RhoA及ROCKⅡ mRNA表達(dá)的影響,探究心包經(jīng)穴改善腦缺血后神經(jīng)功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司統(tǒng)一提供3～4月齡的無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級健康成年雄性Sprague Dawley （SD）大鼠30只,體質(zhì)量（220±30） g,動物合格證號為 SCXK（湘）2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于室溫 22 ℃,相對濕度為 55%～70%的安靜環(huán)境下,其飼養(yǎng)籠具、墊料、飼料、飲水均按照SPF級實(shí)驗(yàn)動物的要求進(jìn)行制備和消毒,造模前先禁食1 d。將大鼠編號后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分組,將30只SD大鼠隨機(jī)分成正常組（6只）、假手術(shù)組（6只）、造模組（18只）;造模成功后,二次隨機(jī)將 18只造模組大鼠分為模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組,每組6只。每組大鼠除正常喂養(yǎng)及相同時間捆綁處理外,正常組不做任何處理,假手術(shù)組曝露并剝離出血管但不插線,模型組采用大腦中動脈缺血模型造模,心包經(jīng)組造模后電針心包經(jīng)穴,肺經(jīng)組造模后電針肺經(jīng)穴。

1.2 主要試劑與儀器

Nogo-A ELISA試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司,AD1514Ra）,RhoA ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司,ml038156）,ROCKⅡELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）,mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,CW2569）。華佗牌毫針0.30 mm×15 mm（蘇州醫(yī)藥用品廠有限公司）,華佗電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,SDZ-Ⅱ）,全自動酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司,PW-812）,多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司,MB-530）,熒光定量 RCP儀（美國 Thermo,PIKOREAL96）,電泳儀（中國北京六一公司,DYY-6C）,切片機(jī)（浙江金華益迪實(shí)驗(yàn)器材,YD-315）。

1.3 模型制備

采用大鼠大腦中動脈持久性局灶性缺血模型,造模方法參照文獻(xiàn)[9-10]報道的造模方式,即頸外動脈插入線栓法建立腦缺血模型。采用Zea Longa 5級4分制評分法評分[9],無神經(jīng)功能缺損計(jì) 0分;缺血對側(cè)伸直障礙、前爪內(nèi)收計(jì)1分;行走往偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分;行走向偏癱側(cè)傾倒計(jì)3分;完全喪失意識、不能行走計(jì)4分。選取評分1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)觀察。假手術(shù)組曝露剝離出血管后,不做其他處理。實(shí)驗(yàn)過程盡量遵循無菌操作的原則,術(shù)后未予以抗感染及營養(yǎng)護(hù)理。所有操作均遵循中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部 2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》[11]。

1.4 干預(yù)方法

參照擬人比照法及《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]動物穴位圖譜定位取穴,并按照手三陰經(jīng)脈“從胸走手”的循行方向,選取缺血對側(cè)肢體不同神經(jīng)節(jié)段的穴位代表心包經(jīng)及肺經(jīng)。即選取天泉、曲澤、大陵和內(nèi)關(guān)四穴代表心包經(jīng);選取天府、尺澤、列缺和太淵四穴代表肺經(jīng)。

造模后第 2天進(jìn)行針刺干預(yù),用自制固定器固定大鼠四肢及頭部并使其面部朝上,用 0.30 mm×15 mm毫針刺入大鼠腦缺血對側(cè)上肢穴位,深度 3～4 mm,接SDZ-Ⅱ型電針治療儀,心包經(jīng)組大陵與內(nèi)關(guān)相接,曲澤與天泉相接,肺經(jīng)組太淵與列缺相接,尺澤與天府相接,電針正極接近心端穴位,負(fù)極接遠(yuǎn)心端穴位,采用連續(xù)波、輸出電壓2～4 V,頻率20 HZ,強(qiáng)度以大鼠局部肢體輕顫為度,干預(yù)時間持續(xù)30 min。每日1次,連續(xù)電針3 d,第4天進(jìn)行取材。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠斷頭后取腦組織,對腦梗死區(qū)進(jìn)行取材,所取組織脫水、包埋、切片后,60 ℃烤片 1～2 h,后將切片置于二甲苯中10 min,2次。然后依次在100%,100%,95%,85%和 75%乙醇中每級放置 5 min,再用蒸餾水浸洗5 min;后蘇木素染5～10 min,蒸餾水沖洗,PBS返藍(lán);伊紅染 3～5 min,蒸餾水沖洗;梯度乙醇（95%～100%）脫水,每級 5 min（或者直接把片子烤干）。取出后置于二甲苯10 min,2次,中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.5.2 血清Nogo-A、RhoA及ROCKⅡ蛋白含量檢測

治療結(jié)束后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛（每100 g體質(zhì)量注射 0.3 mL）麻醉,取4～5 mL腹主動脈血,常溫下靜置2 h然后離心（3000 r/min, 15 min）,移液槍取上清液,遵照相關(guān)試劑盒的操作說明,應(yīng)用ELISA法分別檢測血清Nogo-A、RhoA及ROCKⅡ的濃度。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)物的濃度,縱坐標(biāo)為吸光度（OD）值,并采用“Curve Expert”曲線制作軟件進(jìn)行分析,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值與濃度計(jì)算出回歸方程式,將樣本的OD值代入方程式,計(jì)算出樣本濃度[13]。（稀釋樣本需乘上稀釋倍數(shù),即得樣本的實(shí)際濃度。）

1.5.3 腦梗死區(qū)Nogo-A、NgR1、RhoA及ROCKⅡ mRNA表達(dá)檢測

取約0.02 g大鼠缺血側(cè)腦組織,加入Trizol溶液,研磨勻漿后提取總RNA,并以組織總mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄 cDNA（具體按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行）,取部分cDNA,等比例混勻,稀釋,作為實(shí)時熒光定量 PCR（RT-qPCR）的模板。參照目的基因的序列,運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物（具體見表1）,按SYBR法完成實(shí)驗(yàn)操作（反應(yīng)條件為 95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,30 s;共40個循環(huán)）。計(jì)算方法為△Ct=目的基因 Ct－內(nèi)參基因 Ct,-ΔΔCt=（對照組）ΔCt－各樣品 ΔCt,2-ΔΔCt反映其他各組樣品相對于對照組樣品目的基因表達(dá)水平的比值。正常組、假手術(shù)組參考《大鼠腦立體定位圖譜》[14],選取視交叉至腦橋?qū)俅竽X中動脈供血區(qū)域取材。檢測方法同上。

表1 各檢測指標(biāo)引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。符合正態(tài)分布者,組間比較采用單因素方差分析,方差齊者用LSD法,方差不齊者用Tambane’sT2或Games-Howell法。不符合正態(tài)分布者,采用多個獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠梗死區(qū)腦組織病理學(xué)觀察

正常組、假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整且致密,神經(jīng)元細(xì)胞胞漿豐富,淡染,清晰可見較大核仁;模型組可見大片梗死灶,神經(jīng)細(xì)胞大片消失或細(xì)胞皺縮,出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,核邊集嚴(yán)重,細(xì)胞間間距增大,間質(zhì)染色稀疏;心包經(jīng)組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū)結(jié)構(gòu)較正常組和假手術(shù)組疏松,細(xì)胞排列更紊亂,但較模型組組織結(jié)構(gòu)緊密,細(xì)胞排列更規(guī)則;而心包經(jīng)組缺血壞死區(qū)結(jié)構(gòu)較肺經(jīng)組稍緊密、細(xì)胞排列稍規(guī)則。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)比較（×400）

2.2 各組大鼠血清中Nogo-A、RhoA和ROCKⅡ含量比較

與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、心包經(jīng)組、肺經(jīng)組血清中 Nogo-A含量均增加（P＜0.01,P＜0.05）;與模型組比較,心包經(jīng)組血清中Nogo-A含量下降（P＜0.01）,而肺經(jīng)組 Nogo-A含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與肺經(jīng)組比較,心包經(jīng)組血清中Nogo-A含量顯著降低（P＜0.01）。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、肺經(jīng)組血清中 RhoA含量增加（P＜0.01,P＜0.05）,心包經(jīng)組 RhoA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與模型組比較,心包經(jīng)組血清中RhoA含量降低（P＜0.05）,肺經(jīng)組 RhoA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與肺經(jīng)組比較,心包經(jīng)組血清中 RhoA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、心包經(jīng)組、肺經(jīng)組血清中 ROCKⅡ含量均增加（P＞0.01）,而模型組、心包經(jīng)組、肺經(jīng)組各組血清中ROCKⅡ含量無明顯差異（P＞0.05）。說明電針心包經(jīng)穴能明顯下調(diào)血清中Nogo-A和RhoA含量,但對血清中ROCKⅡ含量無明顯調(diào)節(jié)作用,這可能與實(shí)驗(yàn)樣本過小或（和）電針干預(yù)時間短刺激強(qiáng)度不夠有關(guān)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中Nogo-A、RhoA及ROCKⅡ含量的比較 （±s, pg/mL）

表2 各組大鼠血清中Nogo-A、RhoA及ROCKⅡ含量的比較 （±s, pg/mL）

注：與正常組、假手術(shù)組比較 1）P＜0.01,2）P＜0.05;與模型組比較 3）P＜0.01,4）P＜0.05;與肺經(jīng)組比較 5）P＜0.01

組別 n Nogo-A RhoA ROCKⅡ正常組 6 114.66±10.61 2.24±0.84 42.61±6.89假手術(shù)組 6 115.61±9.96 2.35±0.64 41.25±3.38模型組 6 155.24±14.031） 4.29±0.121） 54.74±3.961）心包經(jīng)組 6 129.81±4.822）3）5） 3.41±0.524） 54.26±7.441）肺經(jīng)組 6 152.07±5.031） 4.63±1.092） 60.28±3.621）

2.3 各組大鼠腦梗死區(qū)中 Nogo-A、NgR1、RhoA及ROCKⅡ mRNA表達(dá)的比較

與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū)Nogo-A mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.01,P＜0.05）;與模型組比較,心包經(jīng)組腦梗死區(qū) Nogo-A mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05）,而肺經(jīng)組Nogo-A mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與肺經(jīng)組比較,心包經(jīng)組腦梗死區(qū)Nogo-A mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū) NgR1 mRNA表達(dá)均增加（P＜0.01）,心包經(jīng)組NgR1 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,心包經(jīng)組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū) NgR1 mRNA表達(dá)均下降（P＜0.01）;與肺經(jīng)組比較,心包經(jīng)組腦梗死區(qū) NgR1 mRNA表達(dá)下降（P＜0.01）。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū)RhoA mRNA表達(dá)均增加（P＜0.01）;與模型組比較,心包經(jīng)組和肺經(jīng)組腦梗死區(qū)RhoA mRNA表達(dá)均下降（P＜0.01）;與肺經(jīng)組比較,心包經(jīng)組腦梗死區(qū) RhoA mRNA表達(dá)下降（P＜0.01）。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組、肺經(jīng)組腦梗死區(qū)ROCKⅡ mRNA增加（P＜0.05）,心包經(jīng)組ROCKⅡmRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;模型組、心包經(jīng)組和肺經(jīng)組各組腦梗死區(qū)ROCKⅡ mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明電針肺經(jīng)穴能有效下調(diào)腦梗死區(qū)NgR1、RhoA mRNA表達(dá),而電針心包經(jīng)穴對腦梗死區(qū) Nogo-A、NgR1、RhoA mRNA表達(dá)均能有效下調(diào),但對腦梗死區(qū)ROCKⅡ mRNA表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用。詳見表3。

表3 各組大鼠腦梗死區(qū)中Nogo-A、NgR1、RhoA及ROCKⅡ mRNA表達(dá)的比較 （±s）

表3 各組大鼠腦梗死區(qū)中Nogo-A、NgR1、RhoA及ROCKⅡ mRNA表達(dá)的比較 （±s）

注：與正常組、假手術(shù)組比較 1）P＜0.01,2）P＜0.05;與模型組比較 3）P＜0.01,4）P＜0.05;與肺經(jīng)組比較 5）P＜0.01

組別 n Nogo-A NgR1 RhoA ROCKⅡ正常組 6 0.836±0.219 0.841±0.196 1.010±0.172 0.874±0.193假手術(shù)組 6 0.712±0.214 0.869±0.210 1.078±0.194 0.792±0.259模型組 6 2.852±0.6281） 20.838±3.3861） 14.354±3.5791） 1.776±0.4832）心包經(jīng)組 6 1.723±0.1821）4） 2.409±0.9933）5） 1.637±0.6261）3）5） 1.107±0.212肺經(jīng)組 6 4.423±1.9912） 6.775±2.2861）3） 5.391±0.9131）3） 2.182±0.7722）

3 討論

目前不少研究認(rèn)為CNS損傷后神經(jīng)細(xì)胞軸突大多可以再生和修復(fù),但其修復(fù)好壞的關(guān)鍵可能涉及多種炎性介質(zhì)及神經(jīng)功能因子[15-16]。Nogo-A是一種較早報導(dǎo)且被證實(shí)參與抑制神經(jīng)細(xì)胞遷移和擴(kuò)散并阻礙軸突再生的重要因子[17-18],其介導(dǎo)的抑制信號通路Nogo-A/NgR1/-RhoA/RockⅡ在CNS損傷后抑制軸突出芽和生長的過程中扮演著重要的角色。除 Nogo-A因子外,NgR1、RhoA、RockⅡ因子同樣可以限制軸突生長和修復(fù)[19-20]。NgR1作為Nogo-A最親密的受體,通常與其一起發(fā)揮抑制神經(jīng)生長的作用[21]。研究證實(shí)運(yùn)用 NgR1拮抗劑在抑制NgR1表達(dá)的同時,可保護(hù)缺血后大腦并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)及軸突再生[22],而抑制RhoA能促進(jìn)小鼠神經(jīng)細(xì)胞生長與分化[23],抑制 ROCKⅡ具有神經(jīng)保護(hù)方面的作用[24]。同時研究發(fā)現(xiàn)[25]通過負(fù)反饋調(diào)節(jié) RhoA/RockⅡ信號通路抑制RhoA及RockⅡ因子的表達(dá),能促進(jìn)神經(jīng)軸突生長及腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)。

缺血性中風(fēng)發(fā)生后,Nogo-A、NgR1、RhoA、RockⅡ因子活動往往增加,研究表明[26-27]Nogo-A通過與NgR1特異性結(jié)合形成相應(yīng)復(fù)合體激活RhoA及Rho相關(guān)激酶（ROCKⅡ）,ROCKⅡ能磷酸化下游的效應(yīng)分子導(dǎo)致神經(jīng)突起回縮及生長錐塌陷,產(chǎn)生抑制軸突再生的作用。陸躍等[28]提出候氏黑散中風(fēng)藥、補(bǔ)虛藥促進(jìn)腦缺血后CNS功能恢復(fù)可能是通過抑制 Nogo-A/NgR 1-RhoA/RockⅡ信號通路實(shí)現(xiàn)的。以上研究結(jié)果表明Nogo-A、NgR1、RhoA、RockⅡ因子無論是單獨(dú)還是聯(lián)合作用均有抑制軸突生長及阻礙CNS功能恢復(fù)的作用。

針灸療法作為中醫(yī)學(xué)重要的治療手段,能有效促進(jìn)腦梗死偏癱患者的神經(jīng)功能恢復(fù),并提高其生活質(zhì)量[29]。實(shí)驗(yàn)研究證明[30-31]針灸可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子、神經(jīng)抑制因子及多種凋亡相關(guān)蛋白抑制缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,達(dá)到保護(hù)缺血灶周圍的神經(jīng)組織,促進(jìn)CNS修復(fù)與重塑的作用。同時這也是針灸治療缺血性中風(fēng)的重要機(jī)制。吳鋒等[32]發(fā)現(xiàn)電針曲池和合谷穴能下調(diào)腦梗死區(qū)Nogo-A和NgR的表達(dá)并促進(jìn)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。譚峰等[33]也發(fā)現(xiàn)通過電針百會和大椎穴可下調(diào)Nogo-A及RhoA的蛋白表達(dá)并降低缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評分。Huang S等[34]還提出電針足三里和曲池穴促進(jìn)神經(jīng)軸突再生正是通過抑制Nogo-A/NgR1-RhoA/RockⅡ信號通路實(shí)現(xiàn)的。

手厥陰心包經(jīng)絡(luò)與心、腦密切相關(guān),既可通過相表里的陽經(jīng)和自身經(jīng)別間接入腦,同時也可借助任督二脈與腦相關(guān)[35]。臨床研究[36-37]也證明電針手厥陰心包經(jīng)能有效改善缺血中風(fēng)患者腦梗死區(qū)血流量,促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù),對中風(fēng)后的情感障礙也有著獨(dú)特的療效[38]。而手太陰肺經(jīng)與手厥陰心包經(jīng)屬上肢同神經(jīng)節(jié)段陰經(jīng),其經(jīng)脈循行與腦無直接聯(lián)系。故本研究將電針心包經(jīng)穴作為一種外源性干預(yù)手段,以上肢同節(jié)段陰經(jīng)的手太陰肺經(jīng)作為對照,觀察大鼠梗死區(qū)腦組織HE染色后組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)以及大鼠腦缺血后血清中 Nogo-A、RhoA、RockⅡ含量和缺血側(cè)腦組織中Nogo-A、NgR1、RhoA及RockⅡ mRNA表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,造模后,模型組大鼠腦組織中出現(xiàn)大片梗死灶,神經(jīng)細(xì)胞大片消失或細(xì)胞皺縮,電針心包經(jīng)和肺經(jīng)能有效改善腦組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài),且心包經(jīng)組略優(yōu)于肺經(jīng)組。模型組大鼠血清中Nogo-A、RhoA、RockⅡ含量及缺血側(cè)腦組織中Nogo-A、NgR1、RhoA及RockⅡmRNA相對表達(dá)均明顯上升,提示腦缺血后激活了相關(guān)因子的表達(dá),而相比于模型組,心包經(jīng)組血清中Nogo-A及RhoA含量明顯下降,而血清中RockⅡ含量無明顯變化。相比于模型組,電針心包經(jīng)穴能明顯下調(diào)缺血側(cè)腦組織中 Nogo-A、NgR1、RhoA mRNA的表達(dá),對RockⅡ mRNA的表達(dá)則無明顯調(diào)節(jié)作用,電針肺經(jīng)穴同樣能下調(diào)缺血側(cè)腦組織中 NgR1、RhoA mRNA的表達(dá),但心包經(jīng)組優(yōu)于肺經(jīng)組。說明電針能有效調(diào)節(jié)缺血側(cè)腦組織中NgR1、RhoA mRNA的表達(dá),且具有經(jīng)脈特異性,即心包經(jīng)組優(yōu)于肺經(jīng)組。同時實(shí)驗(yàn)組同期發(fā)現(xiàn)電針心包經(jīng)能下調(diào)模型大鼠缺血側(cè)腦組織中第7日和21日Nogo-A、NgR1 mRNA 的表達(dá)[39]。

從中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論分析,手太陰肺經(jīng)與腦的聯(lián)系雖不如心包經(jīng)緊密,但《素問》中提到“肺”具有“朝百脈,主治節(jié)”的生理功能,同時“主氣、司呼吸”,能將流經(jīng)肺臟的全身血液進(jìn)行濁氣與清氣交換,再通過宣發(fā)肅降作用將富含清氣的血液輸布全身各處[40],而大腦自然也需要富含清氣的血液來濡養(yǎng)。同時也有研究證實(shí)[41]針刺肺經(jīng)穴腧穴可改變大腦皮層的固有活動,并對其治療心神疾病提供了客觀依據(jù)。以上綜合考慮,針刺心包經(jīng)、肺經(jīng)穴應(yīng)都有利于促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù),對 Nogo-A/NgR1-RhoA/RockⅡ信號通路或其關(guān)鍵分子的表達(dá)應(yīng)有一定的抑制作用。而電針肺經(jīng)穴對血清中Nogo-A、RhoA、RockⅡ含量及腦組織中RhoA、RockⅡ mRNA的表達(dá)均無明顯調(diào)節(jié)作用,目前暫無其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以參照,暫考慮電針干預(yù)時間短刺激強(qiáng)度不夠和（或）實(shí)驗(yàn)樣本量小相關(guān),具體原因需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加干預(yù)時間繼續(xù)觀察研究。

本次實(shí)驗(yàn)中觀察到電針心包經(jīng)穴能明顯下調(diào)腦缺血模型大鼠血清中Nogo-A及RhoA含量及缺血側(cè)腦組織中 Nogo-A、NgR1、RhoA mRNA的表達(dá),但對血清中RockⅡ含量及腦組織中RockⅡ mRNA的表達(dá)無明顯作用。這可能與RockⅡ因子能通過多種渠道影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)[42],其在參與抑制腦缺血后神經(jīng)修復(fù)與再生的同時,也參與了急性腦缺血后細(xì)胞凋亡、氧自由基生成、激活炎癥等多種生物反應(yīng),將造成Rock Ⅱ因子在腦缺血急性期不能穩(wěn)定表達(dá)[43],對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響,但具體是否相關(guān),還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電針心包經(jīng)穴能改善缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài),并通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長抑制信號通路 Nogo-A/NgR1-RhoA/RockⅡ中關(guān)鍵分子基因的表達(dá)促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù),為心包經(jīng)在腦缺血后的神功修復(fù)的治療中提供實(shí)驗(yàn)支持。但電針心包經(jīng)穴是否能通過該通路對腦缺血后神經(jīng)修復(fù)造成影響還有待添加阻滯劑或（和）激動劑進(jìn)一步研究。