NaV1.5鈉通道C末端IQ基序的重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白制備

張峰慧，薛迎春，許興榮，邵冬雪，張晨陽(yáng)，劉巖，蘇敬陽(yáng)，胡慧媛，郝麗英

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

NaV1.5是主要心肌鈉通道，高表達(dá)于心房、心室肌細(xì)胞和浦肯野纖維。NaV1.5通道由28個(gè)外顯子組成，其C末端包含243個(gè)氨基酸（1773-1940a.a.），近端部分由6個(gè)α螺旋（αⅠ～αⅥ）構(gòu)成，αⅥ包含能與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CAM）結(jié)合的IQ基序［1-5］。IQ基序是細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)NaV1.5的關(guān)鍵元件，是耦合EFhand結(jié)構(gòu)域和CAM與Ca2+相互作用的分子開(kāi)關(guān)［6］。鈣離子作為細(xì)胞生長(zhǎng)中的第二信使，參與多種生理過(guò)程，如鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、心臟傳導(dǎo)和基因表達(dá)等［7］。同時(shí)，編碼基因SCN5A突變導(dǎo)致NaV1.5通道結(jié)構(gòu)或功能異常，引起心肌細(xì)胞動(dòng)作電位除極期間通道表達(dá)水平降低，進(jìn)而引發(fā)多種心血管系統(tǒng)疾病，如長(zhǎng)QT綜合征（long QT syndrome，LQTS）、Brugada綜合征和心房顫動(dòng)等。有研究［8］顯示，LQTS已被證明與IQ基序中Ser1904leu突變干擾通道失活并促進(jìn)通道重新開(kāi)放有關(guān)，Ala1924Thr突變導(dǎo)致BrS，但具體機(jī)制尚未闡明。本研究制備了NaV1.5鈉通道C末端IQ基序的重組蛋白，為進(jìn)一步探討NaV1.5鈉通道的分子調(diào)控機(jī)制及相關(guān)心血管疾病的研究提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-3/IQ重組質(zhì)粒、TOP10穿刺菌、BL21化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌委托武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成；AxyPrep質(zhì)粒DNA抽提試劑盒購(gòu)自江蘇康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；胰蛋白胨、酵母提取物均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐西林、溶菌酶、N-lauroylsarcosine、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Precission Protease、Glutathione-Sepharos 4B 購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；其他試劑均購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司。

1.2 重組質(zhì)粒的提取

將武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司提供的表達(dá)有pGEX-6P-3/IQ重組質(zhì)粒的TOP10菌種（20 μL）置于20 mL含0.14 mmol/L氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min搖床振搖培養(yǎng)12 h。當(dāng)其吸光度值（λ=600）在0.8～0.9時(shí)，于12 000g離心1 min，收集菌液。按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度。

1.3 重組質(zhì)粒的鑒定

1.3.1 酶切鑒定：重組質(zhì)粒有BamHⅠ和XhoⅠ2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，故采用雙酶切法處理純化后的重組質(zhì)粒DNA。根據(jù)限制酶使用說(shuō)明書(shū)，取4 μg質(zhì)粒DNA加入到50 μL酶切體系中，單酶切組加入4 μL的BamHⅠ限制酶，雙酶切組分別加入4 μL的BamHⅠ和XhoⅠ限制酶，用滅菌ddH2O補(bǔ)足體積。單酶切條件為37 ℃，10 min，雙酶切條件為初始37 ℃，10 min，后65 ℃，20 min。酶切處理后的質(zhì)粒DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳鑒定。

1.3.2 測(cè)序鑒定：取4 μg經(jīng)上述方法提取的質(zhì)粒DNA送至武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)PubMed網(wǎng)站的BLAST軟件比對(duì)同源性。

1.4 IQ基序與CSL蛋白結(jié)合的預(yù)測(cè)

利用I-TASSER同源建模服務(wù)器對(duì)NaV1.5鈉通道C末端IQ基序和鈣蛋白酶抑素N末端結(jié)構(gòu)域（CSL蛋白）進(jìn)行同源建模，加州大學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在線檢測(cè)服務(wù)器對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，利用分子模擬及藥物設(shè)計(jì)綜合軟件（molecular operating environment，MOE）軟件對(duì)IQ基序和CSL蛋白進(jìn)行去氧加氫等預(yù)處理，使用DOCK分子對(duì)接程序模擬IQ基序與CSL蛋白結(jié)合，對(duì)結(jié)合模型進(jìn)行評(píng)分。

1.5 重組蛋白的表達(dá)

根據(jù)課題組前期對(duì)CaV1.2不同蛋白片段提取方法的總結(jié)，本研究采用超聲破碎法提取IQ蛋白［9］。取60 μL轉(zhuǎn)化有IQ基序重組質(zhì)粒并擴(kuò)增后的BL21菌液，加入到400 mL含有氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、85 r/min振搖培養(yǎng)12～16 h，待測(cè)定菌液吸光度至0.6～1.0時(shí)，加入400 μL 的1 mmol/L IPTG于37℃、120 r/min搖床振搖4 h，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。離心收集細(xì)菌，加入200 μL 1 mol/L溶菌酶、200 μL 1 mol/L DTT、2 mL 15% N-lauroylsarcosine，冰上處理30 min，超聲粉碎細(xì)菌，加入667 μL 30% TritonX-100，冰上處理30 min，收集上清，分裝備用。

1.6 重組蛋白的純化、鑒定與活性檢測(cè)

將蛋白上清液與GS-4B beads 于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀4 ℃孵育過(guò)夜，800 r/min離心3 min 后棄上清，Tris Buffer洗滌3次后，收集蛋白。用上述同樣方法提取純化CSL蛋白［15］，CSL蛋白與GS-4B beads孵育后用5 μL Precission蛋白酶切去GST標(biāo)簽。用Bradford試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

采用pull down方法檢測(cè)GST-IQ蛋白與CSL蛋白的結(jié)合活性。取40 μL連接有GST-IQ蛋白GS-4B beads置于2 mL EP管中，分別加入3 μL 1 mmol/L的CaCl2（Ca2+終濃度為10 μmol/L）溶液和不同濃度的CSL蛋白，使其終濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、5、10、30 mmol/L，用Tris Buffer（pH 8.0）補(bǔ)充至總體系300 μL，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀4 ℃孵育4 h。將經(jīng)15% SDA-PAFE電泳分離后的蛋白凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后掃描凝膠圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用CS Analyzer軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值數(shù)字化，Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaV1.5鈉通道IQ基序重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將預(yù)先設(shè)計(jì)好的人源IQ基序（135 bp）于 pGEX-6P-3質(zhì)粒載體（4 983 bp）的BamHⅠ/XhoⅠ處插入，其中，BamHⅠ酶切位點(diǎn)位于質(zhì)粒載體的945 bp處，XhoⅠ酶切位點(diǎn)位于質(zhì)粒載體的968 bp處，故重組質(zhì)粒全長(zhǎng)5 095 bp，經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后產(chǎn)生2個(gè)基因片段，分別是IQ基序片段135 bp和載體片段4 960 bp。瓊脂糖凝膠電泳的3條泳道內(nèi)分別為完整的IQ重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ單酶切和經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后的質(zhì)粒片段，結(jié)果顯示，雙酶切組4 960 bp和135 bp處出現(xiàn)明顯條帶，其分子量與計(jì)算所得理論值相符，見(jiàn)圖1。

圖1 重組IQ質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Validation of recombinant IQ plasmid construction by agarose gel electrophoresis of restriction enzyme digests

2.2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果（圖2）

圖2 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.2 Verification of recombinant plasmid by DNA sequencing

經(jīng)PubMed網(wǎng)站的BLAST程序比對(duì)，重組質(zhì)粒與人類基因同源性為100 %，插入方向正確，讀碼方向正確，無(wú)移碼突變，進(jìn)一步證明本研究重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 分子對(duì)接結(jié)果分析

采用MOE分子對(duì)接程序模擬IQ基序與CSL蛋白結(jié)合，結(jié)果顯示，2種蛋白分子對(duì)接評(píng)分為47.67，E值為12.63 Kcal/mol。IQ基序與CSL蛋白有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，分別是IQ基序的Arg1910與CSL蛋白模型的Glu14結(jié)合、IQ基序的Arg1913與CSL蛋白模型的His13結(jié)合。Arg1910、Arg1913與CSL蛋白之間的非鍵作用力是氫鍵，結(jié)合能分別是-1.0、-1.0 kcal/mol。由此可見(jiàn)，CSL蛋白可以與NaV1.5鈉通道C末端IQ基序結(jié)合，見(jiàn)表1。

表1 IQ基序與CSL蛋白的分子對(duì)接結(jié)果Tab.1 Results of docking of CSL with the IQ motif

2.4 GST-IQ融合蛋白純度和活性鑒定

經(jīng)SMS在線DNA和蛋白序列處理工具預(yù)測(cè)得的GST-IQ融合蛋白的表觀分子量為30 000。以GST蛋白作為對(duì)照，GST-IQ融合蛋白在30 000左右處可見(jiàn)特異性條帶，且雜帶較少，表明提取純化后獲得純度較高的IQ蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。

圖3 純化后IQ蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified IQ protein

為了考察經(jīng)超聲破碎法提取的GST-IQ蛋白的生物學(xué)活性，并驗(yàn)證MOE預(yù)測(cè)結(jié)果，將純化后的GST-IQ蛋白與不同濃度的CSL蛋白在1 mmol/L Ca2+條件下共同孵育，經(jīng)pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GST-IQ蛋白能夠與CSL蛋白結(jié)合，且隨著CSL蛋白濃度的增加，兩者的結(jié)合量也呈遞增趨勢(shì)（圖4），提示經(jīng)本研究方法提取純化的GST-IQ蛋白具有較好的生物學(xué)活性，適合后續(xù)NaV1.5鈉通道的相關(guān)研究中。

圖4 IQ蛋白和CSL蛋白的pull down分析結(jié)果Fig.4 Pull down assay to assess binding of IQ protein to CSL protein

3 討論

在哺乳動(dòng)物中，電壓門(mén)控鈉通道可以快速開(kāi)放和關(guān)閉，產(chǎn)生的動(dòng)作電位在快速電信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用［10］。有研究［4］表明，存在于心肌細(xì)胞的蛋白可作用于NaV1.5的不同結(jié)構(gòu)域而參與NaV1.5的生物合成、運(yùn)輸、活性調(diào)節(jié)，如CAM等。其中，CAM可以在無(wú)Ca2+（apo）或Ca2+飽和條件下與NaV1.5的IQ基序結(jié)合，使鈉通道緩慢失活曲線右移，進(jìn)而引起動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)［11］。

IQ基序廣泛分布于肌球蛋白和非肌球蛋白中，包括神經(jīng)元生長(zhǎng)蛋白、電壓門(mén)控通道、磷酸酶等，其生物功能廣泛，如參與神經(jīng)元生長(zhǎng)、有絲分裂、電壓門(mén)控通道的信號(hào)傳導(dǎo)等［12］。而位于心肌NaV1.5鈉通道C末端的IQ基序，不僅參與許多蛋白的Ca2+依賴性調(diào)節(jié)，還可能包含一些心臟疾病的突變位點(diǎn)。已知IQ基序在所有鈉通道亞型中是高度保守的，而在CaV1.2中，C末端的IQ基序R1902C突變與家族性自閉癥有關(guān)，這種突變被證明可以誘導(dǎo)Ca2+穩(wěn)態(tài)失活時(shí)的左移，同時(shí)影響IQ基序的構(gòu)象。NaV1.5是一些遺傳性心律失常相關(guān)疾病的突變位點(diǎn)，在IQ基序中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與LQTS3有關(guān)的4個(gè)突變位點(diǎn)，分別是E1901Q、S1904L、Q1909R和R1913H［13］。

IQ基序具有廣泛的生理功能，但目前對(duì)于IQ基序與各種心臟疾病致病機(jī)制之間關(guān)系的研究尚不完善。本研究成功構(gòu)建了IQ基序的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠在大腸桿菌BL21中表達(dá)高濃度蛋白，經(jīng)GS-4B beads純化后，具有較好的純度和生物學(xué)活性。IQ基序是CaM發(fā)揮鈣依賴性失活和鈣依賴性激活功能的主要結(jié)合區(qū)域，而CSL同CaM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于CaV1.2的C末端的IQ區(qū)域，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控通道活性的目的。基于IQ基序在CaV和NaV通道亞型中高度保守，通過(guò)成功構(gòu)建NaV1.5鈉通道的GST-IQ重組蛋白，并經(jīng)pull down 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化后的GST-IQ蛋白是否具有生物學(xué)活性，同時(shí)檢測(cè)該結(jié)合作用的CSL蛋白濃度依賴性，結(jié)果表明，本研究成功制備出具有生物學(xué)活性的重組IQ蛋白，為心肌NaV1.5鈉通道的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)，也為后續(xù)鈉離子通道病的研究和相關(guān)藥物研發(fā)提供了新方向。