肺癌組織中磷脂酰肌醇3激酶、Notch-1水平與預(yù)后關(guān)系

陳浩舟，武愫斌

作者單位：商洛市中心醫(yī)院胸外科，陜西商洛726000

肺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要癥狀表現(xiàn)為咳嗽、痰中帶血或咯血、胸痛、氣急等，其病死率在惡性腫瘤中占據(jù)首位，對(duì)病人的生命健康安全造成嚴(yán)重威脅。目前臨床治療該疾病的方式有很多，其中全胸腔鏡肺葉切除術(shù)作為肺癌根治術(shù)應(yīng)用廣泛，但大多肺癌病人在確診時(shí)已屬晚期，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，雖然手術(shù)治療可延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間，但病人術(shù)后5年生存率依然很低。肺癌的發(fā)生和發(fā)展是由多種基因共同調(diào)控的。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）是細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)分子，有調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的作用。有研究報(bào)道，PI3K與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系。Notch-1是Notch家族的一員，其編碼的蛋白是一種高度保守的細(xì)胞表面受體，Notch信號(hào)的紊亂可直接或間接誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，已有研究發(fā)現(xiàn)Notch-1與乳腺癌、胃癌、宮頸癌等的發(fā)生有關(guān)。但至今關(guān)于PI3K、Notch-1兩者表達(dá)水平與肺癌病人預(yù)后的關(guān)系研究較少，因此本研究對(duì)肺癌病人組織中PI3K、Notch-1水平與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為臨床更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肺癌病人的預(yù)后提供新的指標(biāo)和充足的依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年5月至2014年5月于商洛市中心醫(yī)院行全胸腔鏡肺葉切除術(shù)治療的肺癌病人60例為研究對(duì)象，其中男40例，女20例；年齡（60.46±5.37）歲，范圍為38～75歲。以該60例肺癌病人的癌旁組織為對(duì)照。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床病理學(xué)確診為非小細(xì)胞肺癌病人；②病人臨床病理資料完整；③行切除術(shù)前未進(jìn)行任何放化療；④配合本次研究，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有其他影響病人生存期的疾?。虎诓±碣Y料缺失病人；③不配合本次研究者；④精神病病人。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 免疫組化法檢測(cè)肺癌病人組織中PI3K和Notch

-

1蛋白陽(yáng)性表達(dá)

免疫組化法具體操作步驟如下：（1）對(duì)石蠟包埋的組織進(jìn)行切片（厚度約為4.0 μm），每個(gè)組織切5片，于60℃下烘干2 h后采用二甲苯脫蠟，然后依次用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫（順序依次為：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次；（2）加入過(guò)氧化氫酶阻斷溶液孵育10 min，PBS沖洗；（3）加入非免疫動(dòng)物血清孵育1 h，向每張切片滴加50 μL一抗，于4℃下過(guò)夜孵育，PBS清洗；（4）加生物素標(biāo)記的二抗，孵育10 min，PBS清洗；（5）滴加適量鏈霉抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，孵育10 min，PBS清洗；（6）DAB顯色和蘇木素復(fù)染，用中性樹(shù)膠封固并于顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。用已知陽(yáng)性的病理切片作陽(yáng)性對(duì)照，其中PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用半定量法進(jìn)行描述，即通過(guò)所取樣品的陽(yáng)性染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比來(lái)共同判定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由3位專(zhuān)業(yè)人員獨(dú)立判斷評(píng)定，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，PI3K陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，Notch-1陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分：樣品無(wú)染色0分，樣品呈淺黃色1分，樣品為黃色2分，樣品為棕黃色3分。在顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野，按照陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞率＜10%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞率在10%～50%之間為1分；陽(yáng)性細(xì)胞率在＞50%～75%之間為2分；陽(yáng)性細(xì)胞率＞75%為3分。根據(jù)染色指數(shù)（即染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的評(píng)分乘積）大小將免疫組化結(jié)果進(jìn)行等級(jí)劃分：0～3分為陰性，4～9分為陽(yáng)性。其中陰性表示低表達(dá)，陽(yáng)性表示高表達(dá)。

1.5 隨訪(fǎng)

對(duì)所有肺癌病人進(jìn)行隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截至2019年5月，死亡病人以死亡日期作為隨訪(fǎng)截止時(shí)間，觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)肺癌病人5年生存時(shí)間。該研究隨訪(fǎng)率為100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0進(jìn)行分析，以例（%）表示計(jì)數(shù)資料，行

χ

檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier對(duì)病人5年生存時(shí)間繪制生存曲線(xiàn)，long-rank比較生存差異，logistic多元回歸判斷影響肺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

P

＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)PI3K和Notch

-

1蛋白表達(dá)情況

PI3K在癌組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率81.67%（49/60）顯著高于癌旁組織5.00%（3/60），Notch-1在癌組織中蛋白陽(yáng)性表達(dá)率65.00%（39/60）也明顯高于癌旁組織8.33%（5/60）（

P

＜0.05）。

2.2 PI3K和Notch

-

1表達(dá)情況與病人臨床病理特征的關(guān)系

PI3K和Notch-1表達(dá)陽(yáng)性與病人的性別、年齡、吸煙、飲酒及病理分型情況無(wú)關(guān)（

P＞

0.05）；而與病人的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（

P

＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和Notch-1表達(dá)情況與60例肺癌病人臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PI3K和Notch

-

1表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系

PI3K蛋白陽(yáng)性和陰性表達(dá)的5年生存率分別為8.0%、28.6%（

P

＜0.05）；且PI3K陽(yáng)性病人中位生存時(shí)間為30.26個(gè)月，陰性病人中位生存時(shí)間為42.60個(gè)月（

P

＜0.05）；Notch-1蛋白陽(yáng)性和陰性表達(dá)的5年生存率分別為16.0%、31.4%（

P

＜0.05）；Notch-1陰性病人中位生存時(shí)間為45.88個(gè)月，陽(yáng)性病人中位生存時(shí)間為33.66個(gè)月（

P

＜0.05）。

2.4 影響肺癌病人預(yù)后危險(xiǎn)因素的logistic多元回歸分析

以隨訪(fǎng)5年肺癌病人的生存結(jié)局為因變量（0=存活，1=死亡），TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PI3K及Notch-1表達(dá)水平為自變量，logistic回歸分析結(jié)果顯示：TNM分期、PI3K表達(dá)水平是影響肺癌病人預(yù)后的危險(xiǎn)因素（

P

＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 影響肺癌病人預(yù)后危險(xiǎn)因素的logistic多元回歸分析結(jié)果

3 討論

肺癌是一種起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，具有發(fā)病率、病死率增長(zhǎng)快的特點(diǎn)。肺癌按組織學(xué)亞型主要被分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌較為常見(jiàn)，約占肺癌的85%。相關(guān)報(bào)道稱(chēng)，近年來(lái)肺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。有研究顯示，全球每年新確診的肺癌人數(shù)高達(dá)160萬(wàn)左右，且其病死率很高，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅病人的身體健康和生命安全，同時(shí)也給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找能夠有效提高預(yù)測(cè)肺癌病人預(yù)后的分子指標(biāo)具有很重要的臨床意義。

PI3K由ClassⅠ、ClassⅡ和ClassⅢ三部分組成，是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶。PI3K通路屬于細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳輸通道之一，廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化等，并在多種腫瘤中呈現(xiàn)異?；罨Ｓ醒芯匡@示，PI3K在非小細(xì)胞肺癌中的異?；罨蚀蠹s為50%～70%，目前已成為臨床肺癌研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。而PI3K蛋白是PI3K通路的樞紐，其蛋白和基因的表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。姜霞等研究了RACK1、PI3K及Akt蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義，結(jié)果表明，PI3K蛋白表達(dá)在不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間有顯著差異，且其在肺癌組織中呈高表達(dá)，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了一定的作用。張大勇研究了PTEN基因、PI3K和Survivin基因在非小細(xì)胞肺癌病人腫瘤組織中的表達(dá)水平，并對(duì)其表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌病人的臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，PI3K和Survivin在非小細(xì)胞肺癌病人癌組織中呈高表達(dá)，PTEN為低表達(dá)，且三者作為預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)的因素，對(duì)于臨床評(píng)估非小細(xì)胞肺癌病人預(yù)后效果具有重要價(jià)值。本研究中，PI3K在肺癌組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與臨床TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與病人的性別、年齡、吸煙、飲酒及病理分型情況無(wú)關(guān)；且Kaplan-Meier分析表明PI3K高表達(dá)者中位生存時(shí)間短于低表達(dá)者，多因素logistic分析顯示PI3K是影響肺癌病人預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

Notch通路是一種重要的細(xì)胞間信號(hào)傳遞通道，其主要有Notch配體及Notch受體組成。Notch-1屬于Notch受體的一種，可結(jié)合Notch-1蛋白細(xì)胞膜表面配體來(lái)激活Notch通路，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch通路在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常激活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wang等探討 了c-met和Notch-1共 表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，兩種受體同時(shí)表達(dá)的病人預(yù)后明顯低于未表達(dá)的病人，說(shuō)明兩種受體的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌病人預(yù)后不良相關(guān)。肖維華等研究了Notch-1抗體在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床意義，并對(duì)其預(yù)后的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch-1抗體與小細(xì)胞肺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，Notch-1表達(dá)在小細(xì)胞肺癌的診斷及預(yù)后評(píng)估方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值。本研究中，Notch-1在肺癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與臨床TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Notch-1高表達(dá)者中位生存時(shí)間短于低表達(dá)者。

綜上所述，PI3K、Notch-1在肺癌病人組織中呈高表達(dá)，嚴(yán)重影響病人預(yù)后，且PI3K、TNM分期是肺癌病人預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究因納入樣本量較少，結(jié)果可能存在偏差，為提高研究的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。