馮之文,鮑勝華,張文君,陳曉鵬
作者單位:皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院肝膽外科,安徽蕪湖241001
急性肝衰竭常見誘因包括病毒性肝炎,藥物攝入過量,特異性藥物反應(yīng)或藥物毒性。時至今日急性肝衰竭除了肝移植外尚無有效的治療方法,但因供體短缺限制了肝移植的進行。因此我們迫切地需要尋找治療急性肝衰竭的新方法。研究表明脂多糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠的發(fā)病機制為刺激巨噬細胞釋放大量炎癥相關(guān)因子,進而誘導(dǎo)肝細胞壞死與凋亡。因此研究出抗凋亡的方法可能成為治療急性肝衰竭的新途徑。
微小RNA(microRNAs)是一種長約21~25 nt的非編碼RNA,它在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因的表達并參與機體多種病理生理過程。大量研究表明改變特定microRNAs表達水平可調(diào)節(jié)急性肝衰竭的病理生理過程。Su等研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-674-5P(miR-674-5P)表達水平下調(diào)加重伴刀豆球蛋白(ConA)誘導(dǎo)的急性肝損傷狀態(tài);Yang等也發(fā)現(xiàn)微小RNA-125(miR-125)作為肝細胞凋亡重要調(diào)節(jié)因子,其表達量升高可減弱急性肝衰竭發(fā)展過程。但微小RNA-378(miR-378)在急性肝衰竭過程中的作用機制及是否和肝細胞凋亡過程存在聯(lián)系尚不清楚。研究表明miR-378可以控制肝臟纖維化和減弱脂肪肝的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)miR-378在很多疾病或腫瘤中伴有表達異常,如乳腺癌,而且其是肝細胞肝癌早期診斷與發(fā)現(xiàn)的血清標志物。本研究于2017年1月至2019年1月檢測小鼠急性肝衰竭模型中miR-378是否有表達異常,進一步探究miR-378在急性肝衰竭中作用機制。
1.1 實驗動物
雄性巴比塞(BALB/c)小鼠36只,6~8周,體質(zhì)量(20±2)g,所有實驗鼠由南京大學(xué)實驗動物中心提供,醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號:No.11400700135473,醫(yī)學(xué)實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2012-0001。動物實驗是根據(jù)中國實驗室動物保護協(xié)會發(fā)布的實驗動物的護理和使用指南進行的。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。1.2 主要試劑和儀器
高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(美國Gibco公司),D氨基半乳糖(D-GalN)、脂多糖(美國Sigma-aldrich公司),0.22 μm及0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),兔抗鼠胱天蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(rabbit-anti-Caspase-3 antibody)、兔抗鼠β肌動蛋白(β-actin)抗體(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗體及兔抗鼠二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司),實驗所需試劑盒為RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq PCR反應(yīng)試劑盒(日本TaKaRa公司),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。1.3 方法
(1)急性肝衰竭動物模型的建立。將小鼠以隨機數(shù)字表法平均分成兩組,實驗組用D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合脂多糖10 μg/kg小鼠體質(zhì)量的劑量腹腔注射誘導(dǎo)急性肝衰竭,對照組為腹腔注射等劑量的生理鹽水;每組分為6個時間點分別為誘導(dǎo)后0、1、3、5、7、9 h,每個時間點有3只實驗鼠。在相應(yīng)時間點斷頸法處死小鼠后取靜脈血和肝組織。(2)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定。摘除造模成功的小鼠眼球后取靜脈血,室溫放置2 h后經(jīng)2 000 r/min離心20 min,血清送至皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗科進行生化指標測定。
(3)血清細胞因子TNF-α/IL-6水平測定。血液標本離心15 min(3 000 r/min)后取血清,使用ELISA檢測IL-6、TNF-α水平,具體方法參考試劑盒說明進行。每組實驗重復(fù)3遍。
(4)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。取肝臟組織,根據(jù)RNA提取試劑(Trizol)操作說明測定總RNA量。提取總RNA量后,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)進行RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA),使用適量的cDNA作為PCR模板,RT-PCR擴增儀進行PCR反應(yīng)。我們以β-actin作為RT-PCR內(nèi)參,以U6作為microRNAs內(nèi)參,反應(yīng)體系為20 μL,2方 法 分 析miR-378、TNF-α、IL-6及Caspase-3 mRNA的表達情況。
(5)蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測Caspase-3表達量。組織蛋白溶于細胞裂解液中制備蛋白。用β-actin作為內(nèi)參,使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)印將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后室溫密閉90 min,加入稀釋濃度為1∶1 000的抗Caspase-3單克隆抗體4℃過夜。次日洗一抗,每次10 min,洗3次。后室溫孵育二抗2 h,洗二抗,每次10 min,洗3次,曝光顯影,計算各條帶的灰度值,以β-actin為內(nèi)參。
2.1 急性肝衰竭模型中血清ALT/AST及細胞因子水平的變化
血清中的ALT/AST是評估肝臟損傷的金標準,實驗組在藥物誘導(dǎo)后血清中的ALT/AST逐漸上升,而對照組生理鹽水誘導(dǎo)后ALT/AST水平未見明顯變化,見表1。相比對照組,實驗組TNF-α的mRNA水平在誘導(dǎo)后1 h(P
<0.05)和7 h(P
<0.05)明顯升高;同時血清中的TNF-α水平在誘導(dǎo)后1 h(P
<0.05)和7 h(P
<0.05)也明顯升高。而且IL-6在血清水平和mRNA水平與TNF-α有相似的趨勢。見表2。表1 兩組小鼠在藥物誘導(dǎo)后血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)變化/(U/mL,±s)
表2 兩組小鼠在藥物誘導(dǎo)后1 h和7 h腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)mRNA和血清濃度表達變化/±s
2.2 急性肝衰竭miR
-378及Caspase
-3表達量變化
相較對照組,實驗組小鼠在給藥后5 h和7 hmiR-378表達量明顯降低(均P<
0.05)。相反,實驗組小鼠給藥后5 h和7 hCaspase-3 mRNA表達量明顯升高(均P<
0.05)。同時我們發(fā)現(xiàn)在實驗組中小鼠給藥后5 h和7 h Caspase-3蛋白水平的表達量也明顯升高(均P<
0.05)。見表3,圖1。表3 兩組小鼠在藥物誘導(dǎo)后5 h和7 h miR-378和胱天蛋白酶-3(Caspase-3)表達變化/±s
圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組小鼠在藥物誘導(dǎo)后5 h和7 h Caspase-3蛋白表達結(jié)果
急性肝衰竭臨床表現(xiàn)主要是凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病和腹水等,其進展迅速,死亡率極高。用D-GalN/脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型的方法目前廣泛應(yīng)用于研究人類急性肝衰竭機制的實驗中。我們用D-GalN/脂多糖聯(lián)合誘導(dǎo)建立小鼠急性肝衰竭模型。既往研究表明TNF-α和IL-6在急性肝損傷中可直接反應(yīng)體內(nèi)炎癥程度。我們研究中也發(fā)現(xiàn)急性肝衰竭模型中TNF-α和IL-6在mRNA和血清濃度均明顯升高,可見TNF-α和IL-6確實直接參與了急性肝損傷過程。同時我們在急性肝衰竭模型中發(fā)現(xiàn)血清ALT/AST水平逐漸升高,最終在誘導(dǎo)后7 h達到峰值,之后隨著誘導(dǎo)時間延長其水平降低,這和臨床病人特點相符合。以上血清學(xué)研究結(jié)果可為本實驗提供可靠的急性肝衰竭模型。
微小RNA是近年來備受關(guān)注的一類分子,它是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,研究發(fā)現(xiàn)它參與了生物體多種生理過程。大量研究表明改變特定microRNA表達水平可調(diào)節(jié)急性肝衰竭的病理生理過程。急性肝衰竭組織中檢測miR-378表達量明顯降低,因此我們推測miR-378可能參與急性肝衰竭發(fā)病過程的調(diào)控。D-GalN/脂多糖處理后誘導(dǎo)大量肝細胞損傷,且伴隨肝臟凋亡和壞死性改變。研究表明microRNAs可調(diào)控死亡受體、凋亡及凋亡前基因,然而在小鼠急性肝衰竭模型中microRNAs與細胞凋亡的相互作用機制尚未闡述。因此我們猜測microRNAs可調(diào)控肝細胞凋亡進而影響急性肝衰竭過程。
腫瘤壞死因子是肝細胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素,它與相應(yīng)配體結(jié)合可觸發(fā)一系列的細胞內(nèi)活動的發(fā)生,最終觸發(fā)caspase-3、8、9的活動從而引起凋亡的發(fā)生。實驗中我們發(fā)現(xiàn)血清學(xué)TNF-α水平明顯升高,這些結(jié)果表明凋亡通路在急性肝衰竭發(fā)展過程中具有重要意義。Caspase-3激活可引起PARP底物裂解活化進而使細胞凋亡發(fā)生。實驗證實在急性肝衰竭過程中,caspase-3蛋白水平在肝衰竭發(fā)生過程中增加。綜上表明:在急性肝衰竭發(fā)生過程中肝細胞凋亡增加。
我們發(fā)現(xiàn)在小鼠肝衰竭模型miR-378表達量明顯降低而caspase-3表達明顯升高。TargetScan預(yù)測caspase-3是miR-378可能作用的靶點,據(jù)此我們推測在急性肝衰竭中miR-378低表達可增加caspase-3的表達,最終促進肝細胞凋亡。之前的研究也證實在小腸缺血再灌注損傷和大腦缺血損傷中miR-378可通過靶點caspase-3調(diào)控細胞凋亡。后續(xù)試驗我們需要進一步做細胞功能試驗以期驗證miR-378對肝細胞凋亡的調(diào)控作用??傊覀兊难芯孔C實了在急性肝衰竭過程中miR-378低表達可促進肝細胞凋亡,成果可以為急性肝衰竭的治療提供新的治療方法。