變應(yīng)性支氣管肺曲霉病與過(guò)敏性哮喘病人血清免疫因子差異性的初步探討

吳佳佳，吳戈，胡海圣，廖陳喜，梁翠瑩，孫寶清

作者單位：1廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院，廣東廣州511436；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸健康研究院/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心變態(tài)反應(yīng)科，廣東廣州510120

變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。╝llergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）是一種以曲霉菌誘發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性炎癥為特點(diǎn)的復(fù)雜肺部疾病，主要見(jiàn)于支氣管哮喘或者囊性纖維化病人。在我國(guó)，ABPA多見(jiàn)于哮喘和支氣管擴(kuò)張病人。根據(jù)不同的研究報(bào)道，ABPA在哮喘病人中的發(fā)病率約為2.5%～12.9%不等，而在真菌致敏的哮喘病人中，ABPA的發(fā)病率可達(dá)到40%。

目前，ABPA的具體發(fā)病機(jī)制還不完全明確，普遍認(rèn)為是定植在肺部的煙曲霉誘導(dǎo)機(jī)體的Th2型免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫球蛋白E（IgE）異常升高以及嗜酸性粒細(xì)胞炎癥等。有研究認(rèn)為，在過(guò)敏性哮喘病人中，若對(duì)煙曲霉致敏，隨著體內(nèi)Th2型免疫應(yīng)答的增加，最終可發(fā)展為ABPA。除了一些傳統(tǒng)的Th2型細(xì)胞因子，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）是近年發(fā)現(xiàn)的一種與過(guò)敏性疾病關(guān)系密切的上皮來(lái)源的細(xì)胞因子，其能以特有方式激活樹(shù)突狀細(xì)胞，上調(diào)其表面OX40配體分子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。此外，胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC/CCL17）也在多種過(guò)敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，其主要作用為選擇性誘導(dǎo)T細(xì)胞的遷移，尤其是將Th2細(xì)胞從外周募集至炎癥部位。ABPA與過(guò)敏性哮喘病人雖然同樣存在常規(guī)的變態(tài)反應(yīng)，但在臨床癥狀、疾病發(fā)病機(jī)制方面卻截然不同，所以對(duì)這兩種疾病免疫因子穩(wěn)態(tài)的研究可以為疾病的診治防研提供證據(jù)。然而，對(duì)于ABPA病人與普通的過(guò)敏性哮喘病人血清生物標(biāo)志物差異的研究仍顯不足。為補(bǔ)充我國(guó)ABPA與過(guò)敏性哮喘病人免疫因子穩(wěn)態(tài)差異比較的空白，本研究分析了ABPA與過(guò)敏性哮喘病人血清中多種免疫因子的表達(dá)水平，并分析了這些因子對(duì)ABPA的診療價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接收診治的ABPA病人23例和過(guò)敏性哮喘病人24例。入組標(biāo)準(zhǔn)為病人在臨床上被診斷為ABPA或過(guò)敏性哮喘，同時(shí)排除囊性纖維化的ABPA病人，排除合并肺癌或惡性腫瘤、急性/慢性肺部疾病（如急性肺炎、COPD等）、免疫缺陷或自身免疫疾病以及心臟病的病人。哮喘的診斷基于全球哮喘倡議（GINA）指南，其中包括病人的哮喘臨床特征以及氣流受限情況。在哮喘的病人中，結(jié)合相關(guān)病史資料，若臨床上特異性IgE檢測(cè)結(jié)果/或皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，則可被診斷為過(guò)敏性哮喘。ABPA是根據(jù)國(guó)際人類和動(dòng)物真菌學(xué)學(xué)會(huì)（ISHAM）的診斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)診斷的，即哮喘或囊性纖維化病人滿足下列兩個(gè)必要條件：（1）煙曲霉抗原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性或煙曲霉特異性IgE結(jié)果為陽(yáng)性；（2）血清總IgE水平＞1 000 kUI/L（若其他條件均滿足，總IgE水平可＜1 000 kUI/L）；以及至少滿足兩個(gè)下列次要條件：（1）血清中存在針對(duì)煙曲霉的沉淀或免疫球蛋白G（IgG）抗體；（2）肺部影像學(xué)符合ABPA的特征；（3）血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞500/μL（包括以往的結(jié)果）。本研究獲廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（GYFYY-2016-73），所有病人或其近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1

肺功能檢測(cè)與FeNO檢測(cè)肺功能檢測(cè)包括用力肺活量（FVC）、第一秒用力呼氣容積（FEV）預(yù)測(cè)值的百分比（FVC% pred，F(xiàn)EV% pred）以及一秒率。呼出氣一氧化氮（FeNO）的檢測(cè)（NioxMino，瑞典AerocrineAB公司）在肺功能檢測(cè)之前檢測(cè)。

1.2.2

血清IgE檢測(cè)用含有分離膠的真空采血管收集病人的靜脈血，并以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min獲得血清樣本。將血清樣本分裝并保存在-80℃的超低溫冰箱中，避免反復(fù)凍融。通過(guò)ImmunoCAP 1000系 統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國(guó)）檢測(cè)血清中的總IgE以及特異性IgE的水平。

1.2.3

血清中TSLP、TARC和細(xì)胞因子的檢測(cè)病人血清中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）和胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC）的濃度用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（R&D Systems Inc.，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。血清中的細(xì)胞因子γ干擾素、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13和IL-17A用電化學(xué)發(fā)光法（MSD，MESO QuickPlex SQ 120，Model 1300，USA）進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ABPA與哮喘病人基線特征對(duì)比

如表1所示，兩組病人在年齡、性別與體質(zhì)量指數(shù)（BMI）方面，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。在肺功能方面，ABPA組的FEV% pred顯著低于過(guò)敏性哮喘組（

P

＜0.05）；而FeNO則顯著高于過(guò)敏性哮喘組（

P

＜0.05）。血常規(guī)方面，ABPA組中病人外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于過(guò)敏性哮喘組（

P

＜0.05）。對(duì)于IgE的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，過(guò)敏性哮喘組中有9例病人（37.5%）的煙曲霉特異性IgE結(jié)果為陽(yáng)性。此外，ABPA組總IgE水平顯著高于過(guò)敏性哮喘組（

P

＜0.01）。而在用藥方面，兩組病人口服/吸入糖皮質(zhì)激素的使用比例均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

表1 研究人群基線特征對(duì)比

2.2 兩組血清TARC、TSLP及細(xì)胞因子的水平

兩組之間血清中TARC水平以及TSLP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。對(duì)于所檢測(cè)的細(xì)胞因子，ABPA病人血清中IL-5水平以及IL-8水平均顯著高于過(guò)敏性哮喘病人（均

P

＜0.05）。此外，兩組間血清中其他細(xì)胞因子的比較（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 ABPA與過(guò)敏性哮喘病人間血清中細(xì)胞因子的比較/（ng/L，±s）

2.3 血清IL

-

5和IL

-

8在ABPA中的診斷效能

使用ROC曲線分析血清IL-5和IL-8水平在過(guò)敏性哮喘病人中診斷ABPA的效能。IL-5和IL-8診斷ABPA的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.902（

P

＜0.01）和0.720（

P

＜0.05）（圖1）。根據(jù)約登指數(shù)，IL-5的最佳截?cái)帱c(diǎn)為0.89 ng/L，在此截?cái)帱c(diǎn)的靈敏度和特異度分別為83.33%和90.91%；而IL-8的最佳截?cái)帱c(diǎn)為16.41 ng/L，在此截?cái)帱c(diǎn)的靈敏度和特異度分別為91.67%和54.55%。

圖1 血清白細(xì)胞介素（IL）-5和IL-8水平用于鑒別診斷變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）和哮喘的ROC曲線圖

3 討論

ABPA是一種慢性的肺部疾病，煙曲霉的長(zhǎng)期暴露或定植會(huì)引起過(guò)敏性哮喘病人機(jī)體持續(xù)高水平的Th2型免疫反應(yīng)，使血清IgE水平升高并同時(shí)出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張和持續(xù)性哮喘，并伴隨肺纖維化以及肺功能的喪失。支氣管哮喘是ABPA的易感條件之一。對(duì)過(guò)敏性哮喘與ABPA病人更多有效的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究對(duì)認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)展機(jī)制具有重要作用。

研究表明，氣管上皮細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如TSLP、骨膜蛋白等，均與Th2介導(dǎo)的哮喘相關(guān)，本課題組先前的研究也發(fā)現(xiàn)血清骨膜蛋白水平可作為鑒別診斷ABPA和煙曲霉致敏的過(guò)敏性哮喘的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。然而，本研究的結(jié)果顯示在ABPA和過(guò)敏性哮喘病人間，血清TSLP的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。與之類似，雖然已有研究表明TARC可有效診斷囊性纖維化（CF）病人中的ABPA，但本研究的結(jié)果顯示TARC在過(guò)敏性哮喘病人和ABPA中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞

0.05

）。在檢測(cè)的細(xì)胞因子中，本研究發(fā)現(xiàn)在ABPA和過(guò)敏性哮喘病人中血清IL-5和IL-8的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。ABPA病人血清IL-5水平的升高標(biāo)志著相比于過(guò)敏性哮喘病人，其嗜酸性粒細(xì)胞炎癥可能更為嚴(yán)重。而血清IL-8水平的升高可能與煙曲霉的定植、感染有關(guān)。此外，在其他細(xì)胞因子水平的比較中（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A），兩組病人差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。過(guò)敏性哮喘是一種慢性疾病，主要是由Th2主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致氣管的損傷以及重塑。在ABPA中，機(jī)體通過(guò)模式識(shí)別受體（PRR）途徑識(shí)別曲霉菌，導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子（IL-5和IL-13）增多以及γ干擾素降低。盡管有研究表明過(guò)敏性哮喘病人在病毒感染后會(huì)導(dǎo)致γ干擾素升高，但是本研究中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩組病人血清中γ干擾素表達(dá)的差別（

P

＞0.05）。而對(duì)于血清中IL-13的表達(dá)，結(jié)果與本課題組先前的研究一致：雖然ABPA病人血清骨膜蛋白水平顯著高于哮喘病人，但I(xiàn)L-13作為骨膜蛋白的上游細(xì)胞因子卻在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。在過(guò)敏性哮喘病人中，IL-10的基因以及蛋白表達(dá)降低，在ABPA病人中也會(huì)出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，IL-10表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的增加。嚴(yán)重的哮喘病人血清中IL-17A的表達(dá)上調(diào)，而對(duì)于煙曲霉致敏的嚴(yán)重哮喘病人，他們最終可能發(fā)展為ABPA。在本研究中，兩組血清IL-17A差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

本研究通過(guò)ROC曲線分析了血清IL-5和IL-8鑒別ABPA和過(guò)敏性哮喘的診斷效力，結(jié)果顯示兩者的曲線下面積（AUC）均＞0.7，而IL-5的AUC更是超過(guò)0.9。通過(guò)約登指數(shù)選擇的截?cái)帱c(diǎn)，在IL-5＞0.89 ng/L時(shí)，其靈敏度和特異度均在80%以上。外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)是診斷ABPA的次要條件之一，同時(shí)也有研究報(bào)道了這項(xiàng)指標(biāo)的截?cái)帱c(diǎn)。在ABPA的病理變化過(guò)程中，IL-5和IL-8可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及激活，導(dǎo)致ABPA相比于過(guò)敏性哮喘病人會(huì)有更高水平的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，因此在臨床上檢測(cè)血清IL-5和IL-8水平，可以輔助鑒別診斷ABPA與過(guò)敏性哮喘。

綜上，與過(guò)敏性哮喘病人相比，ABPA血清IL-5和IL-8水平顯著升高，這可能與嗜酸性粒細(xì)胞增多以及煙曲霉的定植相關(guān)。此外，IL-5和IL-8可作為生物標(biāo)志物輔助診斷過(guò)敏性哮喘中的ABPA病人。