變應(yīng)性支氣管肺曲霉病與過敏性哮喘病人血清免疫因子差異性的初步探討

吳佳佳，吳戈，胡海圣，廖陳喜，梁翠瑩，孫寶清

作者單位：1廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院，廣東廣州511436；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院/廣州呼吸健康研究院/呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心變態(tài)反應(yīng)科，廣東廣州510120

變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。╝llergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）是一種以曲霉菌誘發(fā)的變態(tài)反應(yīng)性炎癥為特點(diǎn)的復(fù)雜肺部疾病，主要見于支氣管哮喘或者囊性纖維化病人。在我國，ABPA多見于哮喘和支氣管擴(kuò)張病人。根據(jù)不同的研究報道，ABPA在哮喘病人中的發(fā)病率約為2.5%～12.9%不等，而在真菌致敏的哮喘病人中，ABPA的發(fā)病率可達(dá)到40%。

目前，ABPA的具體發(fā)病機(jī)制還不完全明確，普遍認(rèn)為是定植在肺部的煙曲霉誘導(dǎo)機(jī)體的Th2型免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫球蛋白E（IgE）異常升高以及嗜酸性粒細(xì)胞炎癥等。有研究認(rèn)為，在過敏性哮喘病人中，若對煙曲霉致敏，隨著體內(nèi)Th2型免疫應(yīng)答的增加，最終可發(fā)展為ABPA。除了一些傳統(tǒng)的Th2型細(xì)胞因子，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）是近年發(fā)現(xiàn)的一種與過敏性疾病關(guān)系密切的上皮來源的細(xì)胞因子，其能以特有方式激活樹突狀細(xì)胞，上調(diào)其表面OX40配體分子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。此外，胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC/CCL17）也在多種過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，其主要作用為選擇性誘導(dǎo)T細(xì)胞的遷移，尤其是將Th2細(xì)胞從外周募集至炎癥部位。ABPA與過敏性哮喘病人雖然同樣存在常規(guī)的變態(tài)反應(yīng)，但在臨床癥狀、疾病發(fā)病機(jī)制方面卻截然不同，所以對這兩種疾病免疫因子穩(wěn)態(tài)的研究可以為疾病的診治防研提供證據(jù)。然而，對于ABPA病人與普通的過敏性哮喘病人血清生物標(biāo)志物差異的研究仍顯不足。為補(bǔ)充我國ABPA與過敏性哮喘病人免疫因子穩(wěn)態(tài)差異比較的空白，本研究分析了ABPA與過敏性哮喘病人血清中多種免疫因子的表達(dá)水平，并分析了這些因子對ABPA的診療價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年6月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接收診治的ABPA病人23例和過敏性哮喘病人24例。入組標(biāo)準(zhǔn)為病人在臨床上被診斷為ABPA或過敏性哮喘，同時排除囊性纖維化的ABPA病人，排除合并肺癌或惡性腫瘤、急性/慢性肺部疾?。ㄈ缂毙苑窝?、COPD等）、免疫缺陷或自身免疫疾病以及心臟病的病人。哮喘的診斷基于全球哮喘倡議（GINA）指南，其中包括病人的哮喘臨床特征以及氣流受限情況。在哮喘的病人中，結(jié)合相關(guān)病史資料，若臨床上特異性IgE檢測結(jié)果/或皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)結(jié)果為陽性，則可被診斷為過敏性哮喘。ABPA是根據(jù)國際人類和動物真菌學(xué)學(xué)會（ISHAM）的診斷標(biāo)準(zhǔn)來診斷的，即哮喘或囊性纖維化病人滿足下列兩個必要條件：（1）煙曲霉抗原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽性或煙曲霉特異性IgE結(jié)果為陽性；（2）血清總IgE水平＞1 000 kUI/L（若其他條件均滿足，總IgE水平可＜1 000 kUI/L）；以及至少滿足兩個下列次要條件：（1）血清中存在針對煙曲霉的沉淀或免疫球蛋白G（IgG）抗體；（2）肺部影像學(xué)符合ABPA的特征；（3）血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)＞500/μL（包括以往的結(jié)果）。本研究獲廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（GYFYY-2016-73），所有病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1

肺功能檢測與FeNO檢測肺功能檢測包括用力肺活量（FVC）、第一秒用力呼氣容積（FEV）預(yù)測值的百分比（FVC% pred，F(xiàn)EV% pred）以及一秒率。呼出氣一氧化氮（FeNO）的檢測（NioxMino，瑞典AerocrineAB公司）在肺功能檢測之前檢測。

1.2.2

血清IgE檢測用含有分離膠的真空采血管收集病人的靜脈血，并以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min獲得血清樣本。將血清樣本分裝并保存在-80℃的超低溫冰箱中，避免反復(fù)凍融。通過ImmunoCAP 1000系 統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國）檢測血清中的總IgE以及特異性IgE的水平。

1.2.3

血清中TSLP、TARC和細(xì)胞因子的檢測病人血清中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）和胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子（TARC）的濃度用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（R&D Systems Inc.，美國）進(jìn)行檢測。血清中的細(xì)胞因子γ干擾素、IL-5、IL-8、IL-10、IL-13和IL-17A用電化學(xué)發(fā)光法（MSD，MESO QuickPlex SQ 120，Model 1300，USA）進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 ABPA與哮喘病人基線特征對比

如表1所示，兩組病人在年齡、性別與體質(zhì)量指數(shù)（BMI）方面，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。在肺功能方面，ABPA組的FEV% pred顯著低于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）；而FeNO則顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）。血常規(guī)方面，ABPA組中病人外周血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.05）。對于IgE的相關(guān)檢測結(jié)果，過敏性哮喘組中有9例病人（37.5%）的煙曲霉特異性IgE結(jié)果為陽性。此外，ABPA組總IgE水平顯著高于過敏性哮喘組（

P

＜0.01）。而在用藥方面，兩組病人口服/吸入糖皮質(zhì)激素的使用比例均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。

表1 研究人群基線特征對比

2.2 兩組血清TARC、TSLP及細(xì)胞因子的水平

兩組之間血清中TARC水平以及TSLP水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。對于所檢測的細(xì)胞因子，ABPA病人血清中IL-5水平以及IL-8水平均顯著高于過敏性哮喘病人（均

P

＜0.05）。此外，兩組間血清中其他細(xì)胞因子的比較（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 ABPA與過敏性哮喘病人間血清中細(xì)胞因子的比較/（ng/L，±s）

2.3 血清IL

-

5和IL

-

8在ABPA中的診斷效能

使用ROC曲線分析血清IL-5和IL-8水平在過敏性哮喘病人中診斷ABPA的效能。IL-5和IL-8診斷ABPA的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.902（

P

＜0.01）和0.720（

P

＜0.05）（圖1）。根據(jù)約登指數(shù)，IL-5的最佳截斷點(diǎn)為0.89 ng/L，在此截斷點(diǎn)的靈敏度和特異度分別為83.33%和90.91%；而IL-8的最佳截斷點(diǎn)為16.41 ng/L，在此截斷點(diǎn)的靈敏度和特異度分別為91.67%和54.55%。

圖1 血清白細(xì)胞介素（IL）-5和IL-8水平用于鑒別診斷變應(yīng)性支氣管肺曲霉?。ˋBPA）和哮喘的ROC曲線圖

3 討論

ABPA是一種慢性的肺部疾病，煙曲霉的長期暴露或定植會引起過敏性哮喘病人機(jī)體持續(xù)高水平的Th2型免疫反應(yīng)，使血清IgE水平升高并同時出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張和持續(xù)性哮喘，并伴隨肺纖維化以及肺功能的喪失。支氣管哮喘是ABPA的易感條件之一。對過敏性哮喘與ABPA病人更多有效的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究對認(rèn)識疾病的發(fā)展機(jī)制具有重要作用。

研究表明，氣管上皮細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如TSLP、骨膜蛋白等，均與Th2介導(dǎo)的哮喘相關(guān)，本課題組先前的研究也發(fā)現(xiàn)血清骨膜蛋白水平可作為鑒別診斷ABPA和煙曲霉致敏的過敏性哮喘的一個潛在的生物標(biāo)志物。然而，本研究的結(jié)果顯示在ABPA和過敏性哮喘病人間，血清TSLP的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。與之類似，雖然已有研究表明TARC可有效診斷囊性纖維化（CF）病人中的ABPA，但本研究的結(jié)果顯示TARC在過敏性哮喘病人和ABPA中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞

0.05

）。在檢測的細(xì)胞因子中，本研究發(fā)現(xiàn)在ABPA和過敏性哮喘病人中血清IL-5和IL-8的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05）。ABPA病人血清IL-5水平的升高標(biāo)志著相比于過敏性哮喘病人，其嗜酸性粒細(xì)胞炎癥可能更為嚴(yán)重。而血清IL-8水平的升高可能與煙曲霉的定植、感染有關(guān)。此外，在其他細(xì)胞因子水平的比較中（γ干擾素、IL-10、IL-13和IL-17A），兩組病人差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。過敏性哮喘是一種慢性疾病，主要是由Th2主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致氣管的損傷以及重塑。在ABPA中，機(jī)體通過模式識別受體（PRR）途徑識別曲霉菌，導(dǎo)致Th2型細(xì)胞因子（IL-5和IL-13）增多以及γ干擾素降低。盡管有研究表明過敏性哮喘病人在病毒感染后會導(dǎo)致γ干擾素升高，但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)兩組病人血清中γ干擾素表達(dá)的差別（

P

＞0.05）。而對于血清中IL-13的表達(dá)，結(jié)果與本課題組先前的研究一致：雖然ABPA病人血清骨膜蛋白水平顯著高于哮喘病人，但I(xiàn)L-13作為骨膜蛋白的上游細(xì)胞因子卻在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。在過敏性哮喘病人中，IL-10的基因以及蛋白表達(dá)降低，在ABPA病人中也會出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，IL-10表達(dá)的降低會導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的增加。嚴(yán)重的哮喘病人血清中IL-17A的表達(dá)上調(diào)，而對于煙曲霉致敏的嚴(yán)重哮喘病人，他們最終可能發(fā)展為ABPA。在本研究中，兩組血清IL-17A差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。

本研究通過ROC曲線分析了血清IL-5和IL-8鑒別ABPA和過敏性哮喘的診斷效力，結(jié)果顯示兩者的曲線下面積（AUC）均＞0.7，而IL-5的AUC更是超過0.9。通過約登指數(shù)選擇的截斷點(diǎn)，在IL-5＞0.89 ng/L時，其靈敏度和特異度均在80%以上。外周血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)是診斷ABPA的次要條件之一，同時也有研究報道了這項指標(biāo)的截斷點(diǎn)。在ABPA的病理變化過程中，IL-5和IL-8可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤以及激活，導(dǎo)致ABPA相比于過敏性哮喘病人會有更高水平的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，因此在臨床上檢測血清IL-5和IL-8水平，可以輔助鑒別診斷ABPA與過敏性哮喘。

綜上，與過敏性哮喘病人相比，ABPA血清IL-5和IL-8水平顯著升高，這可能與嗜酸性粒細(xì)胞增多以及煙曲霉的定植相關(guān)。此外，IL-5和IL-8可作為生物標(biāo)志物輔助診斷過敏性哮喘中的ABPA病人。