長(zhǎng)鏈非編碼RNA組蛋白去乙?；?通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡

陳斌，王猛，張囡囡

作者單位：1棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院肝病科，山東 棗莊277000；2棗莊市市中區(qū)人民醫(yī)院感染性疾病科，山東 棗莊277000

肝癌是世界上常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率居所有癌癥第五位，致死率居所有癌癥第二位。由于肝癌的發(fā)病隱匿，一旦確診已至晚期，并且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，以致其致死率極高。因此，研發(fā)有效的治療藥物對(duì)肝癌病人具有重要意義。組蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）具有抑制組蛋白發(fā)生乙?；突蜣D(zhuǎn)錄的作用，其在腫瘤中過度表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)下調(diào)，以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。組蛋白去乙?；?在很多腫瘤中均表現(xiàn)出表達(dá)異常升高，其中包括肝癌，令人遺憾的是其在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞表型變化中的作用尚未十分清楚。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守且廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，歸屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（phosphatidylinositol 3-kinase related kinase，PIKK）家族。mTOR信號(hào)通路抑制劑在癌癥的臨床治療中已得到普遍應(yīng)用，但是該通路是否參與HDAC3在肝癌中的功能機(jī)制尚未完全清楚。本研究于2018年9月至2019年5月擬以肝癌細(xì)胞SK-Hep1為研究對(duì)象，檢測(cè)其中HDAC3的表達(dá)，觀察敲減HDAC3、激活mTOR信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，以期揭示其機(jī)制可能與敲減HDAC3抑制mTOR信號(hào)通路活性相關(guān)，為肝癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

正常肝細(xì)胞細(xì)胞系CVCL_SA11 MIHA、肝細(xì)胞癌細(xì)胞細(xì)胞系CVCL_0525 SK-Hep1均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）；DMEM購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青；CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)sellect公司；Lipofectamine2000、RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；mTOR信號(hào)通路抑制劑MHY1485購(gòu)自美國(guó)AbMole公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自北京雷根生物公司；RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自碧云天公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)將SK-Hep1細(xì)胞和MIHA細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在5%二氧化碳，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組把正常培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期肝細(xì)胞癌細(xì)胞SK-Hep1和肝正常細(xì)胞MIHA標(biāo)記為SK-Hep1組、MIHA組；使用脂質(zhì)體試劑盒Lipofectamine2000將si-NC、si-HDAC3（購(gòu)自上海吉瑪公司）、si-HDAC3+DMSO、si-HDAC3+MHY1485轉(zhuǎn)染至SK-Hep1細(xì)胞，48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率（按照“1.2.3”的方法操作，檢測(cè)各組細(xì)胞中HDAC3的表達(dá)水平，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功）。

1.2.3

qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞 中HDAC3的mRNA表達(dá)收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。qRT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各個(gè)樣本中HDAC3 mRNA的含量。計(jì)算方法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，2法計(jì)算HDAC3的相對(duì)表達(dá)。引物信息（5'-3'）：HDAC3，正向引物GCTGCTGGACATATGAGAC，反向引物TGCCTCTGGCCTGCTATA；GAPDH，正 向 引 物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.2.4

CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的

si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細(xì)胞，將其調(diào)整為10個(gè)/毫升，取100 μL加入到96孔板，培養(yǎng)24 h。然后加入20 μL的CCK-8溶液，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。吸光度與細(xì)胞增殖能力成正比。

1.2.5

Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲為了檢測(cè)si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使用未鋪基質(zhì)膠、鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室分別檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力，二者的操作步驟相同。具體操作方法如下：將細(xì)胞先用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，調(diào)整細(xì)胞至10個(gè)/毫升，取200 μL均勻緩慢注入上室聚碳酸酯膜，600 μL含血清培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。擦下上室聚碳酸酯膜表面細(xì)胞。甲醇固定，結(jié)晶紫染色。最后，用濕棉簽擦去膜上表面剩余的細(xì)胞，再用鑷子輕輕取下聚碳酸酯膜，使其下表面朝上，進(jìn)行載玻片封片。用顯微鏡400倍觀察細(xì)胞的數(shù)量，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.6

膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）/碘化丙啶（PI）雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細(xì)胞，用200 μL結(jié)合緩沖液懸浮。先加入5 μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，然后加入5 μL的PI，結(jié)束染色后，立即上機(jī)，檢測(cè)分析凋亡情況。細(xì)胞的凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1、S6K1蛋白表達(dá)收集si-NC組、si-HDAC3組、si-HDAC3+DMSO組、si-HDAC3+MHY1485組細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，BAC法進(jìn)行定量，100℃水浴變性，12 000 r/min離心10 min，取上清。然后將準(zhǔn)備好的濃縮膠、分離膠小心拔出梳子，取50 μL進(jìn)行上樣，電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜過程需要注意的是整個(gè)儀器和環(huán)境需要保持0～4℃的低溫狀態(tài)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用

2.5

%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，洗膜。將膜浸入500～1 500倍稀釋的各個(gè)一抗反應(yīng)液中孵育過夜。次日，先進(jìn)性洗膜，然后將膜轉(zhuǎn)移至稀釋過的二抗反應(yīng)液中4℃孵育2 h，洗膜。最后，進(jìn)行顯影、定影和曝光，整個(gè)過程需在暗室中進(jìn)行。用Image J分析條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 HDAC3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

與MIHA組比較，SK-Hep1組細(xì)胞中HDAC3的表達(dá)異常升高［（1.00±0.06）比（4.38±0.34），

t

=29.370，

P

＜0.001］。可見，HDAC3在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。

2.2 敲減HDAC3的肝癌細(xì)胞

與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細(xì)胞 中HDAC3 mRNA的 表達(dá)異常降低［（0.32±0.03）比（1.01±0.07），

t

=27.180，

P

＜0.001］。提示，成功構(gòu)建敲減HDAC3的肝癌細(xì)胞。

2.3 敲減HDAC3對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

結(jié)果如表1所示，與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細(xì)胞在48、72h細(xì)胞活性顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05）。

表1 敲減組蛋白去乙?；?（HDAC3）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響/±s

2.4 敲減HDAC3對(duì)肝癌細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路活性的影響

結(jié)果如圖1和表2所示，與si-NC組比較，si-HDAC3組SK-Hep1細(xì)胞中Akt激酶、4E-BP1、p-S6K1蛋白表達(dá)均顯著降低（

P

＜0.001），S6K1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

表2 敲減組蛋白去乙?；?（HDAC3）的肝癌細(xì)胞哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)/±s

圖1 敲減組蛋白去乙?；?（HDAC3）的肝癌細(xì)胞哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5 激活mTOR信號(hào)通路對(duì)敲減HDAC3抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和促進(jìn)凋亡的影響

結(jié)果如表3所示，與si-HDAC3+DMSO組相比，si-HDAC3+MHY1485組SK-Hep1細(xì)胞中HDAC3表達(dá)顯著升高，在48、72 h細(xì)胞活性顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（

P

表3 激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路對(duì)敲減組蛋白去乙?；?（HDAC3）抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和促進(jìn)凋亡的影響/±s

＜0.05）。

3 討論

HDAC3在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，并且其在胰腺癌、乳腺癌、淋巴瘤中均表現(xiàn)出失調(diào)，也包括肝細(xì)胞癌。Lu等在肝癌的研究中報(bào)道，敲除HDAC3后能夠明顯損害肝臟再生和肝細(xì)胞增增，過表達(dá)HDAC3與肝癌的生長(zhǎng)和預(yù)后不良緊密相關(guān)，敲減HDAC3則可以抑制肝癌的生長(zhǎng)。Wu等研究報(bào)道，HDAC2在肝癌病人的腫瘤組織中表達(dá)異常升高，并且其可通過激活Hedgehog信號(hào)通路加重肝癌病人的惡性化進(jìn)程。由此可見，HDAC3在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。我們運(yùn)用檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中HDAC3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)其異常升高，這與前人的研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步研究，我們建立敲減HDAC3的肝癌細(xì)胞，并通過CCK-8、Transwell小室、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡發(fā)現(xiàn)，敲減HDAC3后，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均被抑制，細(xì)胞的凋亡得到促進(jìn)，這揭示了HDAC3對(duì)肝癌細(xì)胞表型變化的調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減HDAC3可抑制肝癌細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路的活性，因此我們認(rèn)為HDAC3在肝癌中的功能可能與該通路具有一定的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號(hào)通路在人類多種癌癥發(fā)生異常。矮甘草皂苷單體13（DT-13）在體外通過激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMPK）并抑制m-TOR來阻斷結(jié)直腸癌腫瘤生長(zhǎng)。mTOR/p70S6K通路在卵巢癌中被激活。卡鉑可迅速mTOR表達(dá)，使卵巢癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)微小RNA-1（miR-1）可通過靶向下調(diào)原癌基因c-Met，調(diào)控Akt/mTOR信號(hào)通路來抑制前列腺癌細(xì)胞的存活和增殖。大量研究報(bào)道，mTOR信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷治療中均具有重要的調(diào)控作用。Malakar等報(bào)道，在肝癌中抑制mTOR的活性能夠逆轉(zhuǎn)原癌基因MALAT1對(duì)肝癌的致癌特性。我們研究發(fā)現(xiàn)，敲減HDAC3能夠抑制肝癌細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因Akt、4E-BP1、p-S6K1的蛋白表達(dá)，揭示敲減HDAC3能夠抑制肝癌中mTOR信號(hào)通路的活性，此結(jié)果為探索肝癌中HDAC3發(fā)揮作用的功能機(jī)制的研究提供了依據(jù)。激活mTOR信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)敲減HDAC3的抑制肝癌細(xì)胞的細(xì)胞表型惡性化發(fā)展的作用。不僅敲減HDAC3能夠抑制mTOR信號(hào)通路的活性，激活mTOR信號(hào)通路也能夠逆向調(diào)控HDAC3的表達(dá)和功能。這為HDAC3在肝癌的診斷、基因治療和靶向治療中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

基于本研究結(jié)果，認(rèn)為長(zhǎng)鏈非編碼RNA HDAC3抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與可能失活mTOR信號(hào)通路相關(guān)。