長鏈非編碼RNA母系表達基因8靶向微小RNA-497-5p調(diào)控血管瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡

張蕾，林瑩波，喬娟，王云璐

作者單位：1河南中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，河南鄭州450046；2廣東茂名健康職業(yè)學(xué)院，廣東茂名525000

血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，通常發(fā)生在嬰兒出生時或出生后兩周，約75%～80%的血管瘤病人為女性。雖然血管瘤是一種良性腫瘤，但嚴重的血管瘤會影響皮膚的功能，給病人及其近親屬帶來沉重的身心負擔(dān)，部分血管瘤的快速生長和侵襲甚至威脅兒童的生命。因此，了解血管瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制對于血管瘤的早期診斷和有效的聯(lián)合治療具有至關(guān)重要的作用。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸與腫瘤細胞的增殖、凋亡、擴散轉(zhuǎn)移以及血管生成有關(guān)的非編碼RNA。劉筱雯通過轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)進行嬰幼兒血管瘤組織lncRNAs表達譜分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA母系表達基因8（maternally expressed gene 8，MEG8）在血管瘤中表達上調(diào)，且通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）驗證表達存在明顯差異。此外，有研究報道MEG8在轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導(dǎo)的肺癌A549細胞和胰腺癌Panc1細胞中表達上調(diào)，參與肺癌、胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表觀遺傳學(xué)進程。但目前MEG8在血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。因此，本研究分析了MEG8在血管瘤組織中的表達，研究MEG8對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖、凋亡的影響及其可能的分子機制，以期為MEG8作為血管瘤的診療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

血管瘤組織（52例，均為增殖期腫瘤組織）和與其對應(yīng)的瘤旁正常皮膚組織（52例）由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院于2017年1月至2018年6月間收集。52例樣本來源于嬰幼兒，其中男性15例，女性37例，年齡為3個月至12歲之間。在開展本研究之前所有病人近親屬均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC細胞購于上?？吕咨锟萍加邢薰?；EBM-2培養(yǎng)基購于Lonza公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；Lipofectamine2000購于Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；Trizol試劑和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）相關(guān)試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；PCR引物、si-MEG8、si-NC、微小RNA（miR）-497-5p mimics、miR-NC、anti-miR-497-5p、anti-miR-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MEG8以 及WTMEG8、MUT-MEG8的構(gòu)建和測序均由北京華大基因公司提供；兔源細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體、兔源P21單克隆抗體、兔源B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）單克隆抗體、兔源Bcl相關(guān)X（Bax）蛋白多克隆抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗均購于Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

用含有10%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)HemEC細胞。培養(yǎng)箱環(huán)境條件是37℃，二氧化碳體積分數(shù)為5%，濕度90%。取對數(shù)生長期的HemEC細胞，按照每孔2×10個細胞的密度接種于6孔板，利用Lipofectamine2000分別將si-MEG8、si-NC、miR-497-5p mimics、miR-NC轉(zhuǎn)染至生長融合度為80%的HemEC細胞，并依次標(biāo)記為si-MEG8組、si-NC組、miR-497-5p組、miR-NC組，培養(yǎng)24～72 h后，檢測轉(zhuǎn)染效果，進行后續(xù)實驗。為驗證MEG8能夠通過調(diào)控miR-497-5p表達，將antimiR-497-5p、anti-miR-NC分別和si-MEG8共轉(zhuǎn)染至HemEC細胞，并依次標(biāo)記為anti-miR-497-5p組、anti-miR-NC組，培養(yǎng)24-72 h后，檢測HemEC細胞的增殖和凋亡情況。

1.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測MEG8和miR

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5p的表達水平

利用Trizol法分別提取52例血管瘤組織和與其對相應(yīng)的瘤旁正常皮膚組織，以及各組HemEC細胞的總RNA，紫外分光光度法測定其濃度后，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA），隨后進行qRT-PCR擴增。2法計算MEG8和miR-497-5p的相對表達水平。

1.4 雙熒光素酶報告基因驗證MEG8和miR

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5p的靶向關(guān)系

利用生物信息軟件預(yù)測MEG8的靶基因。發(fā)現(xiàn)MEG8與miR-497-5p能夠特異性結(jié)合，猜測MEG8和miR-497-5p存在靶向調(diào)控關(guān)系，并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。利用Lipofectamine2000將miR-497-5p mimics和miR-NC分別與WT-MEG8和MUT-MEG8共轉(zhuǎn)染HemEC細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，測定各組HemEC細胞的熒光素酶活性。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測細胞活力

將對數(shù)期HemEC細胞按照2×10個/孔的密度接種于96孔板，按照“1.2”方法轉(zhuǎn)染后，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h時間點加入10 μL的質(zhì)量分數(shù)為5 g/L的MTT試劑，孵育4 h后，棄去上清液，各孔再加入二甲基亞砜試劑150 μL，震蕩10 min至結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

收集各組對數(shù)期

HemEC細胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細胞，離心棄上清液后，用適量的1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10/mL。每管內(nèi)加入100 μL細胞懸液，再向管中加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），室溫避光輕輕地混勻10 min，加入5 μL的碘化丙啶（PI），室溫，避光孵育5 min，加入PBS至500 μL，輕輕混勻，在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測

利用RIPA裂解液裂解各組對數(shù)期HemEC細胞，獲得細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。取30 μg已變性的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），電泳結(jié)束后，利用轉(zhuǎn)膜裝置將已分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用Western封閉液室溫搖床封閉30 min，吸盡封閉液后，用Western洗滌液漂洗膜（共3次，10分鐘/次），然后加入已稀釋的抗cyclin D1（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶2 500）蛋白的Ⅰ抗，室溫孵育2 h后，向已洗滌后的PVDF膜中加入稀釋好的Ⅱ抗，孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色后進行拍照，并用Image J軟件對目的條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 MEG8和miR

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5p在血管瘤組織和瘤旁正常皮膚組織中的表達

qRT-PCR檢測顯示，與瘤旁正常皮膚組織相比，血管瘤組織中MEG8的表達水平顯著升高［（0.33±0.03）比（0.82±0.08），

t

=41.356，

P

＜0.001］，miR-497-5p的表達水平顯著降低［（0.84±0.08）比（0.34±0.03），

t

=42.200，

P

＜0.001］。

2.2 抑制MEG8對細胞HemEC增殖的影響

如表1和圖1所示，與si-NC組比較，si-MEG8組HemEC細胞MEG8的表達水平降低（

P

＜0.05），表明成功構(gòu)建抑制MEG8表達的HemEC細胞株。與si-NC組比較，si-MEG8組HemEC細胞cyclin D1蛋白的表達水平降低，P21蛋白的表達水平升高；細胞在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低（

P

＜0.05）。表明，抑制MEG8能夠抑制血管瘤血管內(nèi)皮細胞增殖。

表1 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC增殖的影響/±s

圖1 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC增殖蛋白表達的影響

2.3 抑制MEG8對細胞HemEC凋亡的影響

如表2所示，與si-NC組相比，si-MEG8組HemEC細胞Bcl-2蛋白的表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）。表明，抑制MEG8能夠促進血管瘤血管內(nèi)皮細胞凋亡。

表2 抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

2.4 MEG8靶向調(diào)控miR

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5p表達

利用生物學(xué)信息軟件在線進行靶基因預(yù)測顯示，見圖2，miR-497-5p和MEG8存在部分連續(xù)結(jié)合位點。與miRNC和WT-MEG8共轉(zhuǎn)染組相比，miR-497-5p和WTMEG8共轉(zhuǎn)染組HemEC細胞的熒光素酶活性降低［（0.37±0.04）比（1.05±0.10），

t

=15.465，

P

＜0.001］；與miR-NC和MUT-MEG8共轉(zhuǎn) 染組 相比，miR-497-5p和WT-MEG8共轉(zhuǎn)染組HemEC細胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（1.07±0.10）比（1.08±0.10），

t

=0.173，

P

=0.866］。pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MEG8組、si-NC組、si-MEG8組四組比較，

F

=195.212，

P

＜0.001。pcDNA3.1-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p表達水平低于pcDNA3.1組［（0.09±0.01）比（0.38±0.05），

P

＜0.05］；si-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p表達水平高于si-NC組［（0.88±0.09）比（0.39±0.05），

P

＜0.05］。以上結(jié)果表明，miR-497-5p是MEG8的靶基因，MEG8可負性調(diào)控miR-497-5p的表達。

圖2 生物學(xué)信息軟件在線預(yù)測母系表達基因8（MEG8）與miR-497-5p結(jié)合位點

2.5 過表達miR

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5p對細胞HemEC增殖、凋亡的影響

如表3，4所示，與miR-NC組比較，miR-497-5p組HemEC細胞miR-497-5p的表達水平上調(diào)（

P

＜0.05），表明已成功構(gòu)建過表達miR-497-5p的HemEC細胞株。與miR-NC組比較，miR-497-5p組HemEC細胞cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平降低，P21和Bax蛋白的表達水平升高（

P

＜0.05）；細胞在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）。表明，過表達miR-497-5p能夠抑制血管瘤血管內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞凋亡。

表3 過表達miR-497-5p對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC增殖的影響/±s

表4 過表達miR-497-5p對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

2.6抑制miR

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497

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5p能逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對細胞HemEC增殖、凋亡的作用

如表5，6所示，與si-NC組相比，si-MEG8組HemEC細胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平降低，P21和Bax蛋白的表達水平升高，在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率降低，細胞凋亡率增加（

P

＜0.05）；與si-MEG8+anti-miR-NC組 相 比，si-MEG8+anti-miR-497-5p組HemEC細胞miR-497-5p、cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達水平升高，P21和Bax蛋白的表達水平降低，在24 h、48 h和72 h時間點細胞存活率增加，細胞凋亡率下降（

P

＜0.05）。以上結(jié)果表明，抑制miR-497-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對血管瘤血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響。

表5 抑制miR-497-5p能逆轉(zhuǎn)抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC增殖的影響/±s

3 討論

近年來，lncRNA在血管瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多研究者的關(guān)注。馬從乾等研究發(fā)現(xiàn)，LINC00152在血管瘤組織中的表達明顯上調(diào)，LINC00152可通過促進血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）表達促進血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和侵襲；Zhao等研究表明，核內(nèi)小RNA宿主基因16（SNHG16）在血管瘤組織中呈高表達，SNHG16通過調(diào)控miR-520d-3p/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）軸，作為細胞增殖、血管形成、遷移和侵襲的競爭性內(nèi)源RNA；Zhang等報道沉默尿路上皮癌相關(guān)1（UCA1）通過上調(diào)miR-200c表達抑制血管瘤內(nèi)皮細胞存活，誘導(dǎo)細胞凋亡，進而抑制血管瘤生長；此外，腫瘤易感性候選基因9（CASC9）和opa相互作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄本1（OIP5-AS1）也參與對血管瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。以上研究提示，lncRNA在血管瘤的進展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，探索與血管瘤相關(guān)的lncRNA，對血管瘤病人的精準(zhǔn)治療具有重大意義。

MEG8基因定位于人14號染色體和鼠12號染色體，是最早在小鼠中鑒定的印記基因。其與父系表達基因Dlk1和Dio3以及若干母系表達基因Gtl2、Meg3、Mirg等構(gòu)成Dlk1-Dio3印記區(qū)域，參與調(diào)控肌肉形成和胚胎發(fā)育。目前，關(guān)于MEG8基因在腫瘤的研究還比較少，僅發(fā)現(xiàn)MEG8在TGF-β誘導(dǎo)的肺癌A549細胞和胰腺癌Panc1細胞中表達上調(diào)，MEG8通過與EZH2蛋白增強子結(jié)合，誘導(dǎo)其募集到miR-34a和miR-203的調(diào)節(jié)區(qū)域，促進H3甲基化，抑制轉(zhuǎn)錄。然而，其人類同系物Meg3基因在腫瘤中的作用被廣泛報道。例如，在宮頸癌中，Meg3表達下調(diào)，過表達Meg3通過靶向miR-21-5p可抑制宮頸癌腫瘤的生長，促進腫瘤細胞凋亡；在胃癌中，Meg3也呈低表達，過表達Meg3通過調(diào)控p53信號通路可抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；此外，Meg3還可發(fā)揮內(nèi)源性miR-494分子海綿作用調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路抑制血管瘤的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，MEG8在血管瘤組織中表達上調(diào)，抑制MEG8能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞凋亡。表明，MEG8在血管瘤中發(fā)揮癌基因作用。

表6 抑制miR-497-5p能逆轉(zhuǎn)抑制母系表達基因8（MEG8）對血管瘤血管內(nèi)皮細胞HemEC凋亡的影響/±s

為探索MEG8調(diào)控血管瘤發(fā)生的分子機制，利用生物信息學(xué)軟件在線進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p是MEG8的潛在靶基因。miR-497-5p是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p在非小細胞肺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中表達下調(diào)，過表達miR-497-5p能夠抑制腫瘤細胞增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，miR-497-5p在血管瘤組織中表達水平顯著下調(diào)。同時通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪偷鞍踪|(zhì)印跡法檢測證實MEG8可靶向負性調(diào)控miR-497-5p表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-497-5p能夠抑制cyclin D1和Bcl-2蛋白表達，促進P21和Bax蛋白表達，抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞凋亡。為進一步證實MEG8通過調(diào)控miR-497-5p表達參與對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的調(diào)控，將si-MEG8和anti-miR-497-5p共轉(zhuǎn)染至血管瘤內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)抑制miR-497-5p表達能夠逆轉(zhuǎn)抑制MEG8對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響。提示MEG8通過靶向調(diào)控miR-497-5p表達促進血管瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，lncRNA MEG8在血管瘤組織中表達顯著上調(diào)，miR-497-5p表達下調(diào)，抑制MEG8通過靶向miR-497-5p能夠抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，MEG8有望成為血管瘤分子治療的新靶點。