龍血素A對骨肉瘤MG63細胞增殖、凋亡的作用及機制

劉亞云 張瑾 彭春光 任招娣 廖衛(wèi)華 邱鵬

【關(guān)鍵詞】龍血素A;骨肉瘤;增殖;凋亡;分子機制

骨肉瘤屬于骨科中常見腫瘤疾病之一。通過保肢治療的方式，一定程度上能夠提高治愈率，骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感程度與骨肉瘤患者的治療效果以及預后恢復情況存在關(guān)系[1]。近幾年，關(guān)于骨肉瘤化療藥物相關(guān)的研究取得了進步，但是依舊存在部分患者對相關(guān)化療藥物的敏感性低或者使用一段時間后出現(xiàn)耐藥性現(xiàn)象，患者預后恢復較差，并且目前用于治療骨肉瘤患者的藥物，副作用均較大。因此，積極尋找療效理想，副作用小的藥物具有重要意義。龍血素A 是血竭總黃酮中的主要活性成分， 具有活血化瘀、消炎鎮(zhèn)痛、促進表皮修復、抗腫瘤等功效[2]。近年來研究顯示[3] 多數(shù)黃酮類化合物具有明顯的抗腫瘤作用，如葛根黃酮可通過上調(diào)Fas、Baxm RNA 的表達水平，下調(diào)Bcl-2 和上調(diào)Bax 蛋白，抑制HL-60 細胞增殖，誘導其凋亡。龍血素A 可通過上調(diào)caspase-3 激活Bax/Bcl-xl 線粒體信號通路誘導乳腺癌細胞凋亡[4]。龍血素A 對骨肉瘤增殖、凋亡是否有影響？通過什么機制影響？因此，本次研究主要探討龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用及可能存在的分子機制。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)以及分組 收集和接種細胞：骨肉瘤MG63細胞株進行培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，獲取細胞，并進行計數(shù)，再加入完全培養(yǎng)基，再將其配置成濃度為1×105 個/mL 的細胞懸液，開始進行細胞接種，將骨肉瘤MG63 細胞接種于96 孔板中再次進行培養(yǎng)，并向每個孔內(nèi)加入劑量為100 μL 完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)后的骨肉瘤MG63 細胞，均分為兩組，即實驗組和對照組，對照組骨肉瘤MG63 細胞僅僅加入完全培養(yǎng)基，實驗組骨肉瘤MG63細胞加入不同濃度龍血素A 進行干預。每組分別設置6 個復孔。

加藥處理：上述骨肉瘤MG63 細胞經(jīng)過培養(yǎng)一段時間以后，過夜孵育培養(yǎng)，取出96 孔板，將其置于倒置顯微鏡，進一步觀察細胞培養(yǎng)情況，若細胞出現(xiàn)明顯貼壁現(xiàn)象，再將原來培養(yǎng)液清除干凈，再分別加入不同濃度的龍血素A 藥物進行干預（0，15，30，60，90，120 μmol/L），藥物劑量均為90 μL，再加入完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)處理，陰性對照組加入完全培養(yǎng)基90 μL，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 CCK-8 檢測細胞增殖 不同濃度的藥物處理24 h、48 h、72 h 后， 清除含藥物干預的培養(yǎng)基， 各組每孔分別加入CCK8 溶液，干預劑量為10 μL，分別將其置于細胞培養(yǎng)箱5% CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測波長為450 nm 的OD值，實驗重復3 次，取實驗結(jié)果的平均值作為最終實驗結(jié)果。

按公式計算生長抑制率= [（ 對照組OD -實驗組OD）/ 對照組OD]×100%。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度，即調(diào)整至1×105 個/mL，并將細胞分別接種于六孔板，于每孔加入2 mL 的細胞懸液;次日細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加藥組沿孔壁小心加入2 mL 含最佳濃度龍血素A培養(yǎng)基溶液，對照組只加入2 mL 的完全培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，置CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，目的是為了確定最佳作用時間;分別通過細胞收集、細胞洗滌、乙醇固定、細胞重懸及染色;最后采用流式細胞儀進行檢測。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 檢測Akt /NF-KB 通路因子（Akt、磷酸化Akt、核蛋白NF-KB） 以及Bax、Bcl-2 蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞，以1×105 個/mL 的密度接種于六孔板，每孔加入2 mL 的細胞懸液;次日細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，實驗組沿孔壁小心加入2 mL 含最佳濃度龍血素A培養(yǎng)基溶液，對照組只加入2 ml 的完全培養(yǎng)基，每組設置3個復孔，置CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)最佳作用時間;進行細胞總蛋白的提取、蛋白濃度測定、SDS-PAGE 電泳、Westernblot 測定。檢測與細胞凋亡有關(guān)Akt /NF-KB 通路的蛋白：Akt、磷酸化Akt、核蛋白NF-KB、Bax、Bcl2 表達情況。

1.5 觀察指標 觀察不同濃度干預后在不同時間點的細胞增殖率、細胞凋亡率、Akt /NF-KB 通路因子（Akt、p-Akt、核蛋白NF-KB） 及凋亡蛋白（Bcl-2、Bax） 表達。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗每組重復3 次，結(jié)果均采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)用x±s 形式表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t 檢驗，多樣本均數(shù)的比較采用方差分析，檢驗水準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖變化 同時間點，不同濃度藥物干預后細胞增殖明顯發(fā)生變化，藥物濃度為60 μmol/L 時，細胞增殖率明顯下降（P<0.05），并且呈現(xiàn)一定濃度劑量依賴性;相同濃度下，不同時間點藥物干預后，隨著時間的延長，細胞增殖率明顯下降（P<0.05），即24 h（48 h） 后，細胞增殖明顯下降?；诖耍罄m(xù)實驗均采用60 μmol/L 進行干預，均干預24 h（48 h），開始檢測后續(xù)實驗指標。詳見表1。

2.2 細胞凋亡 與對照組進行比較，實驗組細胞凋亡率明顯更低（P<0.05）。詳見圖1。

2.3 龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用機制與Akt /NF-KB 通路有關(guān) 與對照組比較，實驗組p-Akt、核蛋白NF-KB、Bcl-2 蛋白表達均明顯更低，Bax 蛋白表達明顯更高，差異顯著（P<0.05），兩組Akt 蛋白表達比較，差異不顯著（P>0.05）。詳見表2、圖2。

3 討論

本次研究主要探討龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用及可能存在的分子機制，首先為了確定龍血素A最佳的干預濃度，分別采用不同濃度0、15、30、60、90、120 μmol/L 龍血素A 進行干預，觀察不同濃度對骨肉瘤MG63 細胞增殖的影響，以及同種濃度下，不同干預時間細胞增殖的變化，研究結(jié)果顯示，60 μmol/L 龍血素A 干預后，細胞增殖率明顯下降，并且與90、120 μmol/L 龍血素A 比較，無顯著差異，表明龍血素A 作為骨肉瘤患者新型藥物，具有一定應用前景[5]。進一步觀察60 μmol/L 龍血素A 干預后，骨肉瘤MG63 細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞凋亡率明顯低于對照組，提示龍血素A 藥物能夠明顯促進骨肉瘤MG63 細胞凋亡[6]。進一步探討其可能存在的分子機制，研究發(fā)現(xiàn)實驗組Akt /NF-KB 通路因子出現(xiàn)明顯變化，實驗組p-Akt、核蛋白NF-KB、Bcl-2 蛋白表達均明顯更低，Bax 蛋白表達明顯更高，提示龍血素A 主要通過抑制Akt /NF-KB 通路從而發(fā)揮對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用及進一步誘導細胞的凋亡[7-8]。Akt /NF-KB 通路可以作為骨肉瘤作用靶點之一。

綜上所述，龍血素A 能夠明顯抑制骨肉瘤MG63 細胞增殖過程，同時進一步誘導細胞凋亡，其主要的分子機制為龍血素A 通過抑制Akt /NF-KB 通路活性，磷酸化Akt，下調(diào)核蛋白NF-KB 表達，上調(diào)Bax 蛋白表達，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達，最終抑制骨肉瘤MG63 細胞增殖，以及誘導MG63 細胞凋亡。