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    AKT3逆轉(zhuǎn)miR-22-3p/29a-3p對LX-2細(xì)胞活化的協(xié)同抑制作用

    2023-08-04 06:50:28張榮花張亞楠韓向陽崔笑妍田曉麗章廣玲劉志勇
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染螢光質(zhì)粒

    張榮花,張亞楠,韓向陽,崔笑妍,田曉麗,章廣玲,劉志勇

    肝纖維化是一種病理性修復(fù)反應(yīng),針對肝臟損傷所產(chǎn)生,其主要特征是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積,慢性肝損傷可發(fā)展為肝硬化,最終發(fā)展為肝癌[1]。越來越多的miRNAs參與到HSCs的增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)、炎癥和凋亡等生物學(xué)功能,調(diào)控肝纖維化。絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)是由AKT1、AKT2和AKT3組成的蛋白激酶家族的創(chuàng)始成員,又稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能,并在許多癌癥中發(fā)揮重要作用[2],miR-433通過下調(diào)靶基因AKT3抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖[3]。課題組前期研究[4]顯示miR-22-3p和miR-29a-3p在膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝纖維化大鼠肝臟和活化的肝星狀細(xì)胞LX-2中低表達(dá),但是AKT3作為miR-22-3p和miR-29a-3p的功能靶基因以及AKT3在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的具體機(jī)制仍未被完全闡明。該研究探討過表達(dá)AKT3能否逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞活化的協(xié)同抑制作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    1.1.1主要試劑 人肝星狀細(xì)胞LX-2購自武漢普諾賽生物有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自北京EallBio公司;TRIzol、LipofectamineTM2000、三氯甲烷購自美國Thermo公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;新快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自莊盟生物有限公司;AKT3兔單克隆抗體購自美國Affinity公司;CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫染液、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國康寧公司;miRNA mimics/NC購自天津中實(shí)同創(chuàng)有限公司;pcDNA3.1、pcDNA3.1-AKT3購自通用生物(安徽)股份有限公司。

    1.1.2主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(型號:BPN-80CH)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司,生物安全柜(型號:AC2-4S1)購自藝斯高(上海)貿(mào)易有限公司;垂直電泳槽(型號:JY-SCZ2+)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,電泳儀電源(型號:DYY-6C)、轉(zhuǎn)印電泳系統(tǒng)(型號:DYY-TC-DYCP-40D)購自北京六一科技有限公司,核酸蛋白檢測儀(型號:Nanodrop 2000)、實(shí)時熒光定量PCR儀(型號:StepOnePlusABI)購自美國Thermo公司;倒置熒光顯微鏡(型號:CKX53)購自日本Olympus公司。

    1.2 生物信息學(xué)分析利用TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,并用TargetScan預(yù)測兩個miRNAs與靶基因的結(jié)合位點(diǎn),RNAhybrid分析計(jì)算miRNAs和靶基因的結(jié)合自由能。將獲得的共同靶基因在仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站上進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia genes and genomes,KEGG)信號通路分析。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。用LipofectamineTM2000試劑將mimics NC、miR-22-3p mimics、miR-29a-3p mimics、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics、pcDNA3.1空載質(zhì)粒、pcDNA3.1-AKT3過表達(dá)質(zhì)粒分別或共同轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.4 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)使用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)水平,反應(yīng)條件為95 ℃、30 s,循環(huán)數(shù)為1;95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,循環(huán)數(shù)為40。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量,GAPDH作為α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原α1鏈(type I collagen α1 chain,COL1A1)和AKT3表達(dá)的內(nèi)參,U6作為miR-22-3p 和miR-29a-3p表達(dá)的內(nèi)參,引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.5 雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分組如下:質(zhì)粒1+mimics NC、質(zhì)粒1+miR-22-3p mimics、質(zhì)粒1+miR-29a-3p mimics、質(zhì)粒2+mimics NC、質(zhì)粒2+miR-22-3p mimics、質(zhì)粒2+miR-29a-3p mimics、質(zhì)粒3+mimics NC、質(zhì)粒3+miR-22-3p mimics、質(zhì)粒3+miR-29a-3p mimics、質(zhì)粒4+mimics NC、質(zhì)粒4+miR-22-3p mimics、質(zhì)粒4+miR-29a-3p mimics。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為200 ng,miR-22-3p/miR-29a-3p mimics或mimics NC轉(zhuǎn)染終濃度為40 nmol/L,每組3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h后按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書裂解細(xì)胞,加入200 μl裂解液裂解后,12 000 r/min離心5 min,每孔取上清液20 μl,加入到避光的96孔板中。然后加入100 μl螢火蟲螢光素酶試劑,測定螢光強(qiáng)度(relative light unit,RLU),再加入100 μl海腎螢光素酶試劑,測定RLU,計(jì)算二者比值。

    1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用RIPA裂解液裂解后用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定,然后用SDS-PAGE進(jìn)行電泳,濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,接著用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗(AKT3,ab 2839860,1 ∶3 000;GAPDH,ab 9485,1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜后,TBST洗膜4次,每次10 min;二抗(ab 6721,1 ∶5 000)室溫?fù)u床孵育2 h,TBST洗膜4次。最后經(jīng)顯影儀成像并使用Image J軟件識別條帶灰度進(jìn)行分析。

    1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組為:mimics NC+pcDNA3.1組、miR-22-3p mimics+pcDNA3.1組、miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1組、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1組、mimics NC+pcDNA3.1-AKT3組、miR-22-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3組、miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3組、miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3組。將miRNAs mimics和pcDNA3.1-AKT3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,使每孔miRNAs mimics或NC的終濃度是50 nmol/L,每孔質(zhì)粒總質(zhì)量是2 μg。各組轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞用胰酶消化后接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔2 000個細(xì)胞。在培養(yǎng)24、48、72、96 h時,分別向各孔中加入10 μl CCK-8試劑和100 μl無雙抗培養(yǎng)基的混合液,孵育2 h后在450 nm波長條件下測定細(xì)胞的吸光度值,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,計(jì)算不同培養(yǎng)時間各組光密度(optical density,OD)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

    1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞按5×104個/孔的密度接種于Transwell小室的上室并加入無血清DMEM培養(yǎng)基,下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng),棄去上室培養(yǎng)液并用棉簽擦凈,結(jié)晶紫染色10 min后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況,隨機(jī)選取視野拍照并用Image J軟件計(jì)數(shù)各組細(xì)胞遷移數(shù),將對照組細(xì)胞遷移數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為1。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,兩組間的差異比較采用雙尾t檢驗(yàn),多組間比較使用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 靶基因的篩選及其KEGG和GO功能分析通過TargetScan、Starbase、miRDB和DIANA預(yù)測miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因,共篩選出24個共同靶基因(圖1A)。然后對篩選出的24個共同靶基因進(jìn)行KEGG和GO功能分析,KEGG通路分析及富集分類結(jié)果顯示,這些共同靶基因與PI3K-AKT、Ras、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase,mTOR)等信號通路相關(guān)(圖1B、1C)。GO分析結(jié)果顯示,在生物過程方面,主要富集在細(xì)胞分化、衰老調(diào)控、細(xì)胞分解代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)等;在細(xì)胞組分方面,主要富集在上皮細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞分化等(圖1D)。

    圖1 生物信息學(xué)網(wǎng)站篩選并分析miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因

    2.2 靶基因的蛋白互作分析STRING網(wǎng)站對24個靶基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作(PPI)分析,其中8個蛋白具有相互作用,且磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤鼠肉瘤同系物(NRAS)、AKT3為排名靠前的3個蛋白,見圖2A,圖中圓圈代表節(jié)點(diǎn),節(jié)點(diǎn)越大則介數(shù)中心度越大,邊的粗細(xì)代表連接評分,邊越粗,蛋白間的互作關(guān)系越強(qiáng)。通過文獻(xiàn)查找、研究現(xiàn)狀、miRNAs靶點(diǎn)評分、保守性分析等多方面的評估,初步確定AKT3為共同候選靶基因。AKT3的PPI分析結(jié)果顯示其與mTOR、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDPK1)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)等蛋白存在相互作用關(guān)系(圖2B)。

    圖2 靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析A:候選靶基因的PPI分析;B:AKT3的PPI分析

    2.3 miR-22-3p和miR-29a-3p mimics轉(zhuǎn)染有效性檢測qRT-PCR法檢測miR-22-3p和miR-29a-3p在LX-2細(xì)胞中的表達(dá)水平。與對照組相比,miR-22-3p mimics組miR-22-3p表達(dá)水平明顯升高,其相對表達(dá)量為42.72±3.77(t=19.16,P<0.000 1);miR-29a-3p mimics組miR-29a-3p表達(dá)水平明顯升高,其相對表達(dá)量為53.09±6.02(t=14.97,P=0.000 1)。以上結(jié)果提示這兩個miRNAs的mimics可有效升高LX-2細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的水平。

    2.4 AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶基因TargetScan查找并繪制miR-22-3p和miR-29a-3p與AKT3的結(jié)合位點(diǎn)圖(圖3A),RNAhybrid數(shù)據(jù)庫查找分析miR-22-3p和miR-29a-3p與AKT3之間的最小配對結(jié)合自由能(MFE)分別為-106.3、-93.8 kJ/mol,提示均具有序列結(jié)合的可能性(圖3B)。雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3C)提示,質(zhì)粒1含有miR-22-3p和miR-29a-3p的結(jié)合位點(diǎn),分別與miR-22-3p或miR-29a-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,螢光素酶活性均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=310.9,P<0.000 1)。質(zhì)粒2突變miR-22-3p結(jié)合位點(diǎn),含有miR-29a-3p結(jié)合位點(diǎn),與miR-22-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,其螢光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.867,P=0.43),而與miR-29a-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,其螢光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.05,P<0.000 1)。質(zhì)粒3含有miR-22-3p的結(jié)合位點(diǎn),突變miR-29a-3p結(jié)合位點(diǎn),與miR-22-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,其螢光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.20,P<0.000 1),而與miR-29a-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,其螢光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.01,P=0.37)。質(zhì)粒4均突變miR-22-3p和miR-29a-3p的結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)與miR-22-3p或miR-29a-3p mimics共轉(zhuǎn)染后,螢光素酶活性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.75,P=0.14)。以上結(jié)果表明AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p共同的靶基因。

    圖3 AKT3是miR-22-3p和miR-29a-3p的共同靶點(diǎn)

    2.5 pcDNA3.1-AKT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效性檢測qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞中AKT3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。pcDNA3.1-AKT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞后,與pcDNA3.1組相比,細(xì)胞中AKT3 mRNA的相對表達(dá)量是15 880±1 641(t=16.76,P<0.000 1),蛋白的相對表達(dá)量是1.48±0.21(t=3.09,P=0.03),見圖4。以上結(jié)果提示LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AKT3后可有效升高細(xì)胞中AKT3的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

    圖4 pcDNA3.1-AKT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有效性檢測

    2.6 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)提示,在轉(zhuǎn)染后的24、48、72、96 h,miR-22-3p和miR-29a-3p mimics不僅可以單獨(dú)抑制LX-2細(xì)胞的增殖,二者的半劑量組合也可以協(xié)同抑制LX-2細(xì)胞的增殖;當(dāng)pcDNA3.1-AKT3質(zhì)粒與兩個miRNAs mimics共轉(zhuǎn)染時,兩個miRNAs mimics對細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用可以被部分逆轉(zhuǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F24 h=229.4,F48 h=153.4,F72 h=89.5,F96 h=78.7,P<0.000 1),即AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用。

    圖5 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞增殖的協(xié)同抑制作用

    2.7 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞遷移的協(xié)同抑制作用Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)所示,miR-22-3p和miR-29a-3p mimics能夠抑制LX-2細(xì)胞的遷移能力,且二者的半劑量組合可協(xié)同抑制LX-2細(xì)胞的遷移能力,pcDNA3.1-AKT3與兩個miRNAs共轉(zhuǎn)染后,兩個mimics對LX-2細(xì)胞遷移的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意與mimics NC+pcDNA3.1組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與mimics NC+pcDNA3.1-AKT3組比較:#P<0.05,##P<0.01;與miR-22-3p mimics+pcDNA3.1比較:&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001;與miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1組比較:$P<0.05,$$P<0.01;與miR-22-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3比較:△P<0.05;與miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1-AKT3比較:▲P<0.05,▲▲P<0.01;與miR-22-3p+miR-29a-3p mimics+pcDNA3.1組比較:@P<0.05,@@P<0.01義(F=95.17,P<0.000 1),即AKT3過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞遷移的協(xié)同抑制作用。

    圖6 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞遷移的協(xié)同抑制作用

    2.8 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞中纖維化標(biāo)志物表達(dá)的協(xié)同抑制作用qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-22-3p和miR-29a-3p能夠單獨(dú)或協(xié)同抑制纖維化標(biāo)志物α-SMA(F=41.54,P<0.000 1)和COL1A1(F=77.34,P<0.000 1)的mRNA表達(dá),pcDNA3.1-AKT3與兩個miRNAs共轉(zhuǎn)染后,LX-2細(xì)胞中的α-SMA和COL1A1的mRNA表達(dá)水平降低可被AKT3過表達(dá)而逆轉(zhuǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞中纖維化標(biāo)志物表達(dá)的協(xié)同抑制作用,見圖7。

    圖7 AKT3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2中纖維化標(biāo)志物表達(dá)的協(xié)同抑制作用

    3 討論

    miRNAs生物學(xué)的一個重要特征就是單個miRNA可以靶向數(shù)百個mRNAs,從而調(diào)節(jié)整個蛋白質(zhì)表達(dá)網(wǎng)絡(luò),一個mRNA可以被多個miRNAs靶向[5]。與這些特性相關(guān)的主要后果有兩個,一是多個miRNAs和其他因素可能會競爭特定mRNAs上的結(jié)合位點(diǎn);二是特定miRNAs靶標(biāo)在不同細(xì)胞中的定位可以影響miRNAs和特定mRNAs之間的預(yù)期相互作用。關(guān)于兩個或多個miRNAs通過靶基因?qū)膊〉淖饔?已有研究[6]表明,miR-140e-5p和miR-146a的協(xié)同作用通過靶向Toll樣受體4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)信號傳導(dǎo)對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。circ-ERBIN通過靶向miR-125a-5p和miR-138-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移,從而協(xié)同增加eIF4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP-1)的表達(dá)增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF-1α)表達(dá)[7]。

    miRNAs與靶基因的相關(guān)研究中,挽救實(shí)驗(yàn)是進(jìn)一步驗(yàn)證二者之間靶定關(guān)系和調(diào)控作用的重要實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)miR-1297或敲低自噬啟動激酶1(ULK1)后可下調(diào)心肌纖維化小鼠原代心肌成纖維細(xì)胞中COL1A1和α-SMA的蛋白水平,ULK1過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-1297對心肌纖維化的調(diào)節(jié)作用[8]。過表達(dá)miR-10a-5p可明顯抑制肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721的遷移、侵襲能力以及EMT進(jìn)程,靶基因著絲粒復(fù)合體亞基1(SKA1)過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-10a-5p對這兩個肝癌細(xì)胞系的抑制作用[9]。Tuo et al[10]研究結(jié)果表明,miR-204-3p抑制間充質(zhì)干細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的極化作用,而過表達(dá)C-X-C基序趨化因子受體(CXCR4)抵消了這一過程。Ren et al[11]發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)DNAJC3-AS1可顯著逆轉(zhuǎn)miR-144誘導(dǎo)的阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的凋亡,逆轉(zhuǎn)miR-144對自噬的抑制。miR-22-3p通過靶向絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)顯著抑制破骨細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[12],miR-29a-3p能夠抑制心臟成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肺動脈相關(guān)的心臟纖維化進(jìn)展[13],課題組前期研究[14]顯示miR-22-3p和miR-29a-3p能夠抑制HSCs的活化以及肝纖維化的進(jìn)程,但是二者聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮作用的機(jī)制目前未見相關(guān)報道。

    本研究通過生物信息學(xué)分析結(jié)合雙螢光素酶報告實(shí)驗(yàn)證明了AKT3為miR-22-3p和miR-29a-3p共同的靶基因,為進(jìn)一步證明miR-22-3p和miR-29a-3p是通過靶向AKT3調(diào)控LX-2細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),設(shè)計(jì)并進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)。CCK-8、Transwell、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,AKT3過表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-22-3p和miR-29a-3p對LX-2細(xì)胞增殖、遷移能力以及肝纖維化標(biāo)志物α-SMA和COL1A1 mRNA表達(dá)的協(xié)同抑制作用。

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