高分辨率熔解曲線檢測(cè)背景下結(jié)核分枝桿菌鏈霉素和乙胺丁醇耐藥模式分析

郭騰飛,王珍珍,,侯 義,趙戰(zhàn)勤,祖向陽,江 濤,薛 云

結(jié)核分枝桿菌感染是世界常見的單病種死亡病因之一[1]。中國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家[2]。結(jié)核的傳播及耐藥模式具有地域差異,而監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的不完全性,阻礙了結(jié)核的及時(shí)診斷及耐藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。近年來分子檢測(cè)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于臨床,使耐藥結(jié)核(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)患者的精準(zhǔn)防控成為可能。其中HRM技術(shù)能同時(shí)分析多種抗結(jié)核藥物的分子易感性,用于補(bǔ)充結(jié)核感染和分子耐藥的流行病學(xué)資料。乙胺丁醇(ethambutol,EMB)和鏈霉素(streptomycin,SM)是治療 DR-TB 的第一組藥物,但其耐藥模式在該地區(qū)卻是空白。引起結(jié)核乙胺丁醇耐藥(ethambutol resistance,EMB-R)的分子機(jī)制主要是基因EmbB和EmbC突變;鏈霉素耐藥(streptomycin resistance,SM-R)主要是由基因rrs和Rpsl 43及88位密碼子的突變引起[3-4],不同國(guó)家和地區(qū)的結(jié)核耐藥突變位點(diǎn)也有所不同。該研究旨在結(jié)核感染群體特征的宏觀現(xiàn)象上,分析EMB及SM的耐藥特征及耐藥在堿基水平的微觀表現(xiàn),這將有助于改進(jìn)現(xiàn)有的快速耐藥檢測(cè)技術(shù),探索藥物活性的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料該研究對(duì)洛陽市和縣區(qū)(偃師縣、欒川縣、嵩縣縣、汝陽縣、洛寧縣、孟津縣、新安縣、宜陽縣、伊川縣)2019年1月—2021年 12月期間所有的臨床確診及疑似病例的痰液、胸水或肺泡灌洗液行HRM擴(kuò)增后將陽性結(jié)果納入分析。分析前按照姓名、性別、年齡、地區(qū)等因素排除重復(fù)檢測(cè)者,將年齡<15歲和年齡>86歲的個(gè)體匯總為單一年齡類別,其他均按5年為一個(gè)單位。變量包括檢測(cè)日期、HRM陽性結(jié)果(乙胺丁醇和鏈霉素耐藥結(jié)果)、性別、年齡、地區(qū)(縣區(qū)統(tǒng)一歸為鄉(xiāng)鎮(zhèn)區(qū)域)、痰涂結(jié)果和系統(tǒng)記錄或自我報(bào)告的治療史。

疑似和確診病例:經(jīng)臨床診斷已明確有結(jié)核分枝桿菌感染或過往感染的群體;抗結(jié)核治療失敗,有結(jié)核治療史或既往結(jié)核感染未徹底治愈;有臨床癥狀或潛伏感染者;免疫病理有結(jié)核分枝桿菌感染特征者;影像學(xué)有感染提示者;排菌患者密切接觸者;結(jié)核菌素試驗(yàn)強(qiáng)陽反應(yīng)。

1.2 病例診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS196-2017)[5],根據(jù)治療史對(duì)患者進(jìn)行分類,初治結(jié)核病。初治患者指符合下列情況之一:① 從未因結(jié)核病應(yīng)用過抗結(jié)核藥物治療的患者;② 正進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案規(guī)則用藥而未滿療程的患者;③ 不規(guī)則化療未滿1個(gè)月的患者。復(fù)治患者指符合下列情況之一:① 因結(jié)核病不合理或不規(guī)則用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的患者;② 初治失敗和復(fù)發(fā)患者。

1.3 基因突變位點(diǎn)檢測(cè)該研究采用HRM針對(duì)EMB耐藥高突變的embB基因(embB 306、embB 406、embB 497、embB 368/378/380)進(jìn)行檢測(cè),SM檢測(cè)主要是rpsL基因43、88位密碼子和rrs基因的513～517位點(diǎn)及905～908位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用STATA/SE 15.1軟件對(duì)所有可能與EMB-R和SM-R發(fā)生有關(guān)的變量納入多變量Logistic回歸分析,同時(shí)對(duì)不同治療史、區(qū)域分布、痰涂結(jié)果背景下的性別及耐藥情況行Pearson卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 按性別分層的鏈霉素和乙胺丁醇耐藥結(jié)果2019—2021年,該地區(qū)共有2 941例非重復(fù)HRM陽性病例中SM、EMB耐藥率初診患者分別為17.3%和7.4%,復(fù)治患者分別為25.8%和12.1%,城市患者分別為21.3%和9.8%,農(nóng)村患者分別為16.6%和6.9%,痰涂陽性人群分別為17.8%和6.9%,痰涂陰性分別為19.2%和9.0%。SM-R和EMB-R按性別分層檢出性差異見表1。

表1 HRM陽性人群特征及在不同因素下SM-R和EMB-R情況[n(%)]

2.2 不同變量下的鏈霉素和乙胺丁醇耐藥結(jié)果SM-R和EMB-R因性別、年齡、結(jié)核治療史及地區(qū)分布有關(guān)?？傮w而言,在結(jié)核分枝桿菌感染患者中,SM耐藥率男性為19.0%,女性為16.5% (χ2=2.309,P=0.129),EMB耐藥率男性為8.0%,女性為7.9%(χ2=0,P=0.987)。初診和復(fù)診群體中SM耐藥率分別為17.3%和25.8% (χ2=15.192,P<0.001),而EMB耐藥率則為7.4%和12.1%(χ2=9.557,P=0.002)。該研究對(duì)初復(fù)診群體不同性別的EMB-R和SM-R檢出率行χ2檢驗(yàn)分析顯示,EMB-R差異存在于初診男性及復(fù)診男性之間(χ2=6.340,P=0.012)及初診女性與復(fù)診男性之間(χ2=5.786,P=0.016);SM在復(fù)診男女之間耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.690,P=0.406)。在城市和鄉(xiāng)村患者中SM的耐藥率分別為21.3%和16.6%(χ2=9.927,P=0.002),EMB的耐藥率分別為9.8%和6.9%(χ2=8.115,P=0.004)。SM-R的檢出無論是鄉(xiāng)村男女,還是城市與鄉(xiāng)村的男女之間均有差異,但在城市男女之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.850,P=0.356);而EMB-R在城市與鄉(xiāng)村不同性別之間耐藥性差異更不明顯。痰涂陽性群體對(duì)SM和EMB耐藥率分別為17.8%、6.9%,而痰涂陰性為19.2%、9.0%。EMB-R在痰涂陽性和痰涂陰性群體之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.979,P=0.028),SM-R在痰涂陽性群體男女之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.974,P=0.015)。對(duì)不同年齡范圍群體的耐藥率分析可知,年齡<51歲群體對(duì)SM耐藥率高于年齡>50歲群體(χ2=12.572,P<0.001)。

2.3 按年齡分層的耐藥結(jié)果SM耐藥率最高的年齡范圍是31～35歲(32.2%),與其他所有年齡類別相比,31～35歲的男性(38.9%)及56～60歲女性(26.7%)對(duì)SM耐藥率最高。EMB耐藥率高峰出現(xiàn)在21～25歲(12.7%)的年齡范圍,男性對(duì)EMB耐藥率峰值(15.8%)與總體EMB耐藥率一致,均是21～25歲,女性對(duì)EMB耐藥率峰值的年齡范圍依舊是56～60歲,耐藥率為12.8%。按年齡類別分類的HRM陽性結(jié)果總數(shù)以條形圖表示,SM和EMB耐藥率以折線表示(第二y軸)。見圖1。

圖1 按年齡和性別分類的HRM陽性結(jié)果及SM-R和EMB-R的比例A:按年齡和性別分類的HRM陽性結(jié)果例數(shù)及SM耐藥率;B:按年齡和性別分類的HRM陽性結(jié)果例數(shù)及EMB耐藥率

2.4 多因素Logisitic回歸分析結(jié)果采用多因素Logisitic回歸分析來確定性別、年齡、治療史、地區(qū)、痰涂、年份是否與SM-R及EMB-R的檢出相關(guān)。結(jié)果顯示,男性、年齡<51歲、城市和結(jié)核治療史均與SM-R和EMB-R風(fēng)險(xiǎn)增加呈正相關(guān)(表2)。在調(diào)整了痰涂結(jié)果和檢測(cè)年份的影響后,男性被診斷為SM-R的可能性高于女性;51歲及以下被診斷為SM-R的可能性高于50歲以上個(gè)體;與無治療史個(gè)體相比,有結(jié)核治療史被診斷為SM-R及EMB-R的可能性更高;城市群體被診斷為SM-R和EMB-R的可能性高于鄉(xiāng)村。

表2 鏈霉素耐藥和乙胺丁醇耐藥的多項(xiàng)式Logistic回歸分析[n(%)]

2.5 引起鏈霉素和乙胺丁醇耐藥基因位點(diǎn)引起SM-R的基因突變中,單位點(diǎn)突變率為91.8%,其次是雙位點(diǎn)8.2%。在單位點(diǎn)突變中,rpsL 43位密碼子突變率最高,為59.0%,其次是rpsL 88和 rrs 905～908位點(diǎn),在全部突變模式中分別占16.4%和13.1%,另外有rrs 513～517單位點(diǎn)突變率為3.3%;另外該研究表明rpsL 43聯(lián)合 rrs 905～908及rpsL 88聯(lián)合 rrs 905～908位點(diǎn)的雙位點(diǎn)突變率分別為4.9%、3.3%。而EMB-R的分子突變位點(diǎn)中,只發(fā)現(xiàn)了單位點(diǎn)突變,其中embB 306、embB 406、embB 497和embB 368/378/380的突變率分別為66.7%、18.4%、10.7%和4.3%。引起SM和EMB同時(shí)耐藥的分子模式,主要是rpsL 43聯(lián)合embB 306,rpsL 88聯(lián)合embB 497,rpsL 43聯(lián)合embB 406和rpsL 88聯(lián)合embB 306,分別占全部突變模式的52.1%、16.0%、10.5%和6.8%。見圖2。

圖2 結(jié)核分枝桿菌基因耐藥相關(guān)突變率

3 討論

本研究揭示了該地區(qū)高風(fēng)險(xiǎn)人群SM和EMB耐藥模式及耐藥相關(guān)的危險(xiǎn)因素。該地區(qū)SM和EMB耐藥率分別是18.4%和8.0%,低于青海省的40.9%和30.3%[6],而高于山東省的14.7%和2.6%[7]。2019—2021年期間SM-R和EMB-R的檢出率均有下降趨勢(shì)。這說明近幾年來該地區(qū)在結(jié)核病督導(dǎo)短程化療DOTS戰(zhàn)略上的總體布局是有成效的。

第5次結(jié)核耐藥的全國(guó)調(diào)查報(bào)告顯示,初診病例SM和EMB的耐藥率分別為27.7%和4.9%,復(fù)治病例耐藥率分別是37.2%、17.2%[8],而在該地區(qū)SM和EMB的初診耐藥率分別是17.3%和7.4%,復(fù)診耐藥率則是25.8%和12.1%。該地區(qū)初診耐藥率從2019—2021年有下降趨勢(shì),但初診群體中EMB的耐藥率依舊高于全國(guó)水平,說明仍需要通過加強(qiáng)結(jié)核患者的管理,降低耐藥率。該地區(qū)復(fù)診耐藥率明顯高于初診個(gè)體,且近3年來SM-R檢出率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(25.0%、19.4%、32.0%),提示該研究仍需要加強(qiáng)服藥依從性宣傳及管理,另外由于MTB藥敏結(jié)果耗時(shí)較長(zhǎng),臨床對(duì)于結(jié)核患者的初期治療更加依賴于經(jīng)驗(yàn)性用藥,這也在一定程度上增加了結(jié)核桿菌的獲得性耐藥,因此基層地區(qū)急需要更快速、更準(zhǔn)確的藥敏檢測(cè)手段輔助臨床精準(zhǔn)抗結(jié)核。

鄉(xiāng)村HRM檢出率卻遠(yuǎn)低于城市,這可能是因?yàn)獒t(yī)療水平的差異,鄉(xiāng)村在對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)核病例的初篩的確定性上有待進(jìn)一步考證。城鎮(zhèn)群體SM和EMB耐藥率均高于鄉(xiāng)村,這說明城市是耐藥結(jié)核的高負(fù)擔(dān)地區(qū)。結(jié)核是聚集性傳染病,特別容易在高密度人群中播散。而城市人口密度相對(duì)較大,流動(dòng)性強(qiáng),而且因?yàn)獒t(yī)療水平等差異可能會(huì)使得疑難、復(fù)雜結(jié)核感染病例更加向城市集中。另外據(jù)研究[9]表明,高精神壓力和低身體質(zhì)量指數(shù)是結(jié)核感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

雖然該地痰涂陰性群體的SM及EMB耐藥率均高于痰涂陽性群體,但只有EMB-R在痰涂陽性和痰涂陰性群體之間差異顯著,多因素回歸模型中痰涂陰性對(duì)結(jié)核耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加的OR值比較接近于1,所以痰涂結(jié)果是否作為結(jié)核耐藥的危險(xiǎn)因素,還有待在擴(kuò)大標(biāo)本量且排除抽樣偏倚等因素下再進(jìn)一步考證。

多因素回歸模型顯示,男性、結(jié)核治療史、年齡<51歲及城市分布均是導(dǎo)致SM-R及EMB-R風(fēng)險(xiǎn)增加的因素。有學(xué)者表示結(jié)核耐藥風(fēng)險(xiǎn)與性別密切相關(guān)[10],有報(bào)道[11]則稱結(jié)核耐藥與性別無關(guān)。在該研究中,雖然男性對(duì)SM和EMB的耐藥率均高于女性,但其耐藥差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此,性別是否能使結(jié)核耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。SM和EMB耐藥率均出現(xiàn)在年輕的群體中(SM-R 31～35歲,EMB-R 21～25歲),年齡<51歲群體耐藥率高于年齡>50歲的群體,且年齡<51歲對(duì)SM-R和EMB-R的檢出均是危險(xiǎn)因素,這與之前的研究[12]一致,但與安徽省及臺(tái)灣地區(qū)的耐藥性的年齡類別不一致[11,13],這說明通常被認(rèn)為是低危人群的年輕人可能需要額外的耐藥結(jié)核檢測(cè)。該研究中由于年齡<15歲和年齡>85歲群體的結(jié)核耐藥性數(shù)據(jù)過少,該課題組將在今后的研究中進(jìn)一步探究。

該地區(qū)SM耐藥機(jī)制復(fù)雜,其主要是rpsL 43和 rpsL 88突變引起的,其次是rrs 905～908,這與國(guó)內(nèi)其他地方的報(bào)道[14]相似,另外還有部分SM-R是由rpsL聯(lián)合rrs突變引起,尤其是集中在rpsL 43、88位密碼子和 rrs 905～908位點(diǎn)的聯(lián)合突變。臨床上通常將embB 306作為 EMB 耐藥診斷標(biāo)志物。在該地引起EMB-R的分子基礎(chǔ)主要是embB 306和embB 406的單基因突變,這與一些研究[15-16]結(jié)果相似。了解和阻斷rpsL 43、rpsL 48、rrs 905～908和embB 306的突變規(guī)律及傳播機(jī)制,對(duì)于阻止結(jié)核耐藥的發(fā)生及擴(kuò)散都是十分重要且必須的。

該研究是首次較大范圍揭示該地區(qū)結(jié)核耐藥的分子基礎(chǔ),可為后期探究耐藥結(jié)核的分子生物標(biāo)志或者基因篩選提供初始數(shù)據(jù),另外對(duì)該地區(qū)結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的防治具有重要意義。研究未通過基因測(cè)序來進(jìn)一步確認(rèn)HRM檢測(cè)到的單個(gè)核苷酸突變多態(tài)性或與耐藥相關(guān)的多個(gè)突變的準(zhǔn)確性,該課題組會(huì)在今后的研究中繼續(xù)探明。