2012年度侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)侵襲性酵母菌感染的分布特征

段思蒙 肖盟 黃晶晶 王賀, 張戈 張京家 康巍 王瞳 肖玉玲 倪芳 高嵐美 葉麗艷 郭鵬豪 萬喆 陳中舉 楊青 林潔 胡慶豐1 李虹玲1 岳娜1 崔蘭英1 李剛1 范會1 蘇丹虹1 劉麗文 田素飛 趙聲遠(yuǎn) 杜雪飛2 周宏偉2 徐英春

[1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730；2.“侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷”北京市重點實驗室，北京 100730；3. 丹娜(天津)生物科技有限公司，天津 300451；4. 四川大學(xué)華西醫(yī)院，成都 610041；5. 江蘇省人民醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，南京 210029；6. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福州 350001；7. 解放軍總醫(yī)院，北京 100036； 8. 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510080；9. 北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034；10.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，武漢 4300030；11. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，杭州 310003；12. 杭州邵逸夫醫(yī)院，杭州 310016 ；13. 浙江省人民醫(yī)院，杭州 310014；14.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長沙 410008；15.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；16.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150001；17.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750001；18.山東省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021；19.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120；20.遼寧省人民醫(yī)院，沈陽 110000； 21.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001；22. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025；23. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，哈爾濱 150001；24. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州 310052]

侵襲性真菌病是臨床的一類重要疾病，已成為醫(yī)內(nèi)感染的重要部分。隨著易感人群的增加，侵襲性真菌病的發(fā)病率逐年上升，病死率居高不下[1]。最常見的病原菌是以念珠菌為主的酵母菌，其中，白念珠菌最多，其次為光滑念珠菌。中國醫(yī)院侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)是中國首個針對侵襲性真菌病的全國性多中心研究。本研究作為CHIF-NET項目的一部分，收集了中國地區(qū)22家醫(yī)院1619株酵母樣真菌，通過菌種鑒定、體外藥物敏感性等數(shù)據(jù)分析，為侵襲性酵母菌感染的診治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集中國醫(yī)院侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHIF-NET)中15個省份22家醫(yī)院2012年度(2011年8月1日—2012年7月31日)門急診及住院患者檢出的侵襲性酵母菌菌株，同時收集菌株相關(guān)的臨床及實驗室信息，包括患者年齡、性別、菌株分離時患者所在的科室(門診、急診、病房，病房細(xì)分科室包括內(nèi)科、外科、ICU、其他科室)。侵襲性酵母菌收集的標(biāo)本類型包括外周血、其他部位(包括腹水、膿腫、靜脈導(dǎo)管、腦脊液、肺泡灌洗液、膽汁、胸水、組織、關(guān)節(jié)積液和胃液)，剔除同一患者7 d內(nèi)同一部位重復(fù)分離的菌株。

1.2 主要儀器與試劑

梅里埃基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(VITEK-MS)(法國bioMérieux公司)，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基 (Chromagar)，沙堡弱培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar, SDA，英國Oxoid公司)，Mueller-Hinton瓊脂(葡萄糖美蘭MH瓊脂)。氟康唑藥敏紙片(25 μg,Oxiod)，伏立康唑藥敏紙片(1 μg,Oxiod)，Mueller-Hinton瓊脂(葡萄糖美蘭MH瓊脂)。

1.3 菌種鑒定

凍存菌種送至中心實驗室(北京協(xié)和醫(yī)院)后接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基，35℃孵育48 h后取單菌落于沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)進(jìn)行純化孵育，采用Vitek MS進(jìn)行復(fù)核鑒定, 對于疑難及少見菌株再進(jìn)行ITS1/ITS4核糖體轉(zhuǎn)錄間區(qū)(rDNA internal transcribed spacer region，ITS)測序分析, 確保菌株鑒定的準(zhǔn)確性。

1.4 體外藥敏試驗

將2%葡萄糖加入BBL Mueller-Hinton Ⅱ型的瓊脂,再加0.5 μg/mL亞甲藍(lán)，制備4 mm厚的瓊脂板。將念珠菌落混入生理鹽水制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，用一次性無菌棉拭子蘸取制備好的菌懸液均勻涂抹到瓊脂表面。將氟康唑(25 μg/片)和伏立康唑(1 μg/片)紙片貼于瓊脂表面，35℃孵育24 h。特殊生長緩慢的分離株(如隱球菌屬)需延長培養(yǎng)。使用CLSI M44-A文件推薦的紙片擴(kuò)散法測定氟康唑和伏立康唑的抑菌圈直徑并根據(jù)CLSI菌種特異性折點對藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。

以白念珠菌ATCC 90028和近平滑念珠菌ATCC 22019作為藥敏質(zhì)量控制菌。根據(jù)CLSI菌種特異性折點對藥敏結(jié)果進(jìn)行判定，針對白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌采用CLSI M60念珠菌折點分析，對于其他念珠菌仍采用CLSI M44-S3進(jìn)行分析。光滑念珠菌對于伏立康唑的敏感性根據(jù)流行病學(xué)折點(ECV)進(jìn)行判定。分離株原始鑒定結(jié)果與復(fù)核鑒定結(jié)果對比中，顯著錯誤(major errors)為菌種鑒定錯誤，非顯著錯誤(minor errors)為正確鑒定到屬，但未鑒定到種或正確鑒定到菌種復(fù)合體。

2 結(jié) 果

2.1 侵襲性酵母菌分布情況

CHIF-NET項目2012年度收集的1619個菌株中，白念珠菌整體分離率高達(dá)43.48%(見表1)。念珠菌屬中白念珠菌所占比例47.4%，其次為熱帶念珠菌(18.0%)、近平滑念珠菌復(fù)合體(16.2%)、光滑念珠菌復(fù)合體(12.0%)。隱球菌屬中，97.1%為新生隱球菌復(fù)合體，毛孢子菌屬總體少見，其中最長見的仍為阿薩希毛孢子菌(77.8%)，具體情況見表2。

表1 1619株酵母菌菌種分布情況

表2 1619株酵母菌樣本分布情況分析

2.2 樣本分布

樣本類型中，血流來源的標(biāo)本類型菌株數(shù)量最多(626株，38.7%)，其次為腹水標(biāo)本(354株，21.9%)及膿腫(159株，9.8%)。念珠菌屬在大部分的標(biāo)本類型中最為常見，其中在血流標(biāo)本分離菌株中占94.4%(591株)；相比血流中隱球菌僅為3.4%(21株)。念珠菌屬中常見的白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等菌種，非血流標(biāo)本比例大于血流標(biāo)本比例(血流標(biāo)本比例：25.0%～41.6%)。相比，近平滑念珠菌復(fù)合體在血流標(biāo)本的比例(154/472)明顯高于非血流標(biāo)本(見表1)。

2.3 患者性別比例、年齡分布

檢出侵襲性酵母菌患者中男性占比一半以上(62.14%)，女性患者相對較少(37.80%)；年齡范圍0～94歲，其中≥65歲患者498例(30.76%)。

2.4 科室分布

在分離的菌株中，急診患者5.37%(87例)，門診患者3.15%(51例)，未知病區(qū)患者54例。1427(88.14%)例住院患者中，內(nèi)科檢出24.21%(392例)，外科27.24%(441例)，ICU29.28%(474例)，其他科室(包括兒科、婦產(chǎn)科、皮膚科、五官科、中醫(yī)科病房等)占比較少(共7.41%)。檢出率最高的科室為ICU。

2.5 菌株鑒定復(fù)核情況

CHIF-NET 2012年中所有收集的菌株采用Vitek MS進(jìn)行鑒定，質(zhì)譜鑒定未出結(jié)果的菌株采用分子測序方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。Vitek MS和ITS測序鑒定發(fā)現(xiàn)，復(fù)核鑒定與原始鑒定的一致率為87.28%(1413/1619)。以復(fù)核鑒定的結(jié)果為準(zhǔn)，評價項目中各單位常規(guī)方法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，其中4株擬平滑念珠菌被錯誤鑒定為近平滑念珠菌，25株熱帶念珠菌被錯誤鑒定為白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌。錯誤鑒定的菌還有白念珠菌、光滑念珠菌，也包括葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、解脂念珠菌等臨床非常見菌株(見表3)。

表3 1619株分離株原始鑒定與復(fù)核鑒定對比

(續(xù)表) %

2.6 體外藥敏試驗

1619株分離株藥敏結(jié)果見表4，念珠菌屬中常見的白念珠菌對氟康唑較為敏感(99.2%)，其次為近平滑念珠菌復(fù)合體和熱帶念珠菌，依次為93.7%和91.7%。白念珠菌、近平滑念珠菌復(fù)合體和熱帶念珠菌對伏立康唑敏感的菌株百分比分別為99.5%、95.0%、92.5%。分離株對氟康唑和伏立康唑的敏感程度從整體來看較接近。白念珠菌和近平滑念珠菌對兩種唑類藥物的敏感性都很高(>93%),熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別為6.3%和5.9%，其中6%出現(xiàn)交叉耐藥。

表4 2012年CHIF-NET 1619株酵母菌氟康唑及伏立康唑體外藥敏試驗

(續(xù)表) %

2.7 不同菌株在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的分布差異

雖然白念珠菌為臨床最常見的念珠菌種，但其發(fā)生率在不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)存在顯著差異，最高為北京協(xié)和醫(yī)院(PU)，占12.78%，最低為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(Z2)，僅占1.14%。除東北地區(qū)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(H1)以外，白念珠菌是所有參與研究單位分離株中最常見的念珠菌種，熱帶念珠菌在近一半(45.45%)的醫(yī)院是檢出率排名第二的念珠菌種，發(fā)生率在16.67%～29.79%之間(見圖1)。

圖1 2012年參與CHIF-NET的22個監(jiān)測點在全國的分布情況。BD：北京大學(xué)第一醫(yī)院；FJ:福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院；G1：廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院；GH：解放軍總醫(yī)院；GZ：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院；H1：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；H4：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院；HX：四川大學(xué)華西醫(yī)院；JS：江蘇省人民醫(yī)院；LR：遼寧省人民醫(yī)院；NX：寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；PU：北京協(xié)和醫(yī)院；RJ：上海市瑞金醫(yī)院；SD：山東省立醫(yī)院；TJ：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院；TZ：天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；XY：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院；Z1：中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；Z2：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院；Z3：浙江省人民醫(yī)院；ZD：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院；ZS：杭州邵逸夫醫(yī)院

3 討 論

CHIF-NET 2012中國多中心侵襲性酵母菌感染的臨床研究結(jié)果表明：念珠菌屬仍然是最常見的侵襲性酵母菌感染病原體，占分離株的91.8%,其中白念珠菌最為常見占47.4%，與文獻(xiàn)報道一致[2]。在血流樣本分離株中，白念珠菌的分離率依然位居榜首(34.0%)，這一點不同于美國(38.0%)[3]。由非白念珠菌引起的菌血癥超過一半[4-5]，近平滑念珠菌和熱帶念珠菌是位于第2、3位的導(dǎo)致血流感染的病原菌(見表2)。在全球范圍內(nèi)，白念珠菌仍是主要病原菌。

從流行病學(xué)角度分析，納入研究的病例中，男性占62.1%，女性占37.8%，其中≥65歲患者占30.76%，長期使用抗菌藥物的高齡患者易感染。本監(jiān)測顯示，ICU檢出率最高，其次為外科及內(nèi)科。全球范圍內(nèi)ICU侵襲性真菌感染的問題亦很嚴(yán)峻[6]。本研究對2012年22家參與單位侵襲性酵母菌分布特點及體外藥敏結(jié)果做了研究分析，為酵母菌感染的診治提供依據(jù)。

研究對1619株真菌進(jìn)行了復(fù)核鑒定，復(fù)核正確率為87.2%。由于目前實驗室常規(guī)基于生化鑒定的方法不能區(qū)別鑒定到種水平，其中25種似平滑念珠菌被鑒定為近平滑復(fù)合體。此外，還有部分菌株無鑒定結(jié)果如季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌。臨床對于侵襲性真菌病的診治取決于分離菌株的正確鑒定與否，故實驗室在真菌的診斷方面，不僅需要使用常規(guī)的表型鑒定方法，還需要結(jié)合分子生物學(xué)的方法進(jìn)行確認(rèn)，研究可以看出，參與的醫(yī)療機(jī)構(gòu)利用常規(guī)的監(jiān)測手段鑒定念珠菌的準(zhǔn)確率僅為60.1%，其中出現(xiàn)把季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、近平滑念珠菌等錯誤鑒定為無名念珠菌的情況，研究中亦發(fā)現(xiàn)毛孢子菌屬的鑒定錯誤，其中3株阿薩希毛孢子菌被錯誤鑒定為白念珠菌，這可能和表型鑒定錯誤相關(guān)。而測序方法雖準(zhǔn)確性高，但也有一定的局限性，如方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，成本也相對較高。綜合考慮，想要兼顧準(zhǔn)確性及較低的成本，VITEK MS略顯其優(yōu)越性。

研究中大部分的白念珠菌(79.83%，736/922)、光滑念珠菌(87.08%，155/178)、近平滑念珠菌(93.78%，226/241)對氟康唑和伏立康唑較敏感，伏立康唑?qū)巳崮钪榈拿舾行钥蛇_(dá)91%以上，侵襲性真菌感染的藥物治療中氟康唑不良反應(yīng)小，氟康唑的大量使用已使念珠菌病的致病菌譜發(fā)生了顯著變化，對氟康唑的敏感性也明顯下降。唑類是治療念珠菌感染最常用的藥物，除了固有耐藥比如克柔念珠菌，其他念珠菌如白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌在長期用藥以及過度用藥的情況下亦會出現(xiàn)耐藥[7-11]。近平滑念珠菌對棘白菌素類藥物MIC和其他念珠菌比較相對較高[12]，因此唑類耐藥的近平滑念珠菌將限制臨床的可用治療方案，對臨床意義重大[13]。除此之外，也有少見的念珠菌出現(xiàn)唑類交叉耐藥的情況，如5.99%的熱帶念珠菌和4.56%的近平滑念珠菌出現(xiàn)了氟康唑和伏立康唑的交叉耐藥，出現(xiàn)在非同一醫(yī)療機(jī)構(gòu)中。CHIF-NET2012研究中熱帶念珠菌的交叉耐藥率已經(jīng)高于近平滑念珠菌復(fù)合體和白念珠菌，尤其是血流感染，應(yīng)引起關(guān)注。