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    DNA微陣列芯片在皮膚分枝桿菌感染中的早期診斷價(jià)值

    2021-09-01 00:56:20余茜聞?shì)W旸高志琴楊連娟
    中國(guó)真菌學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    余茜 聞?shì)W旸 高志琴 楊連娟

    (同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院真菌病科,上海 200443)

    皮膚分枝桿菌感染是由分枝桿菌感染所致的皮膚及皮下組織的慢性肉芽腫性病變,其致病菌種類(lèi)繁多。目前皮膚科較為常見(jiàn)的致病菌[1-2]是不典型(非結(jié)核)分枝桿菌,主要包括海分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌等。盡管引起皮膚分枝桿菌感染性肉芽腫的致病菌可能不同,但是其組織病理學(xué)特征相似,主要表現(xiàn)為混合炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[3],因此確診只能通過(guò)病原菌的鑒定。

    臨床上對(duì)皮膚分枝桿菌感染的病原學(xué)診斷較為困難,傳統(tǒng)的檢測(cè)方法[4]效率低、時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣,延誤診斷可能導(dǎo)致治療失敗,因此臨床上亟待一種能快速鑒定病原體的診斷技術(shù)。DNA微陣列芯片檢測(cè)技術(shù)[5]是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù),以其高敏感、高通量和便捷為特點(diǎn),可以快速對(duì)臨床可疑樣本做出病原學(xué)診斷。本研究以臨床上疑似皮膚分枝桿菌感染的患者為研究對(duì)象,與傳統(tǒng)的分枝桿菌細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)和鑒定作對(duì)比,了解DNA微陣列芯片技術(shù)在皮膚分枝桿菌感染中的診斷價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    收集2020年1月—2020年12月我院門(mén)診收治的疑似皮膚分枝桿菌感染的患者6例。收集患者的臨床資料、病史以及皮膚組織和/或膿液,皮膚組織標(biāo)本分為3份:1份進(jìn)行病理學(xué)檢查,1份進(jìn)行病原學(xué)培養(yǎng),1份進(jìn)行DNA微陣列芯片檢測(cè)。本研究經(jīng)上海市皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),全部調(diào)查和取樣均取得患者同意并簽署知情同意書(shū)。

    1.2 儀器與試劑

    應(yīng)用博奧公司的分枝桿菌菌株鑒定芯片以及微陣列芯片掃描儀LuxScan 10K/B進(jìn)行芯片檢測(cè)。分枝桿菌菌株鑒定芯片可檢測(cè)臨床常見(jiàn)分枝桿菌的17個(gè)種或群,包括胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌,以及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

    1.3 方法

    皮膚組織培養(yǎng)及病原菌鑒定 患者活檢后取新鮮皮膚組織和/或膿液,剪碎后研磨,用無(wú)菌接種環(huán)接種于羅氏培養(yǎng)基上,32℃培養(yǎng);待有細(xì)菌生長(zhǎng)(2~12周)后使用無(wú)菌接種環(huán)挑取合適大小的菌落,提取菌落DNA,使用16S rDNA(引物為27F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3; 1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min, 95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,35個(gè)循環(huán),72℃終延伸7 min,反應(yīng)完成后取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段;回收PCR產(chǎn)物,使用測(cè)序儀ABI 3730-XL進(jìn)行DNA測(cè)序,將測(cè)序得到的基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列作對(duì)比分析,進(jìn)行同源性比較。

    DNA微陣列芯片檢測(cè)皮膚組織分枝桿菌 患者活檢后取新鮮皮膚組織和/或膿液,剪碎后研磨,提取皮膚組織DNA備用。取2 μL提取的DNA模板,加入18μL鑒定試劑盒反應(yīng)體系中,進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)條件:37℃ 10 min,94℃ 10 min后, 94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 40s,35個(gè)循環(huán),94℃ 30s,72℃ 1 min,10個(gè)循環(huán),72℃終延伸7 min。將PCR產(chǎn)物與雜交緩沖液混合后水浴鍋中95℃變性5 min,隨后立即置于冰水混合物中冰浴3 min,吸取13.5 μL雜交混合物經(jīng)加樣孔加入微陣列芯片中,將密封好的雜交盒置于50℃水浴2 h。洗滌芯片后干燥,置于微陣列掃描儀LuxScan 10K/B中,使用相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)的讀取和結(jié)果判讀。

    2 結(jié) 果

    2.1 基本資料

    6例患者中男性4例,女性2例;年齡36~62歲,中位數(shù)年齡55.5歲;病程1~5個(gè)月,平均2.67±1.63個(gè)月。發(fā)病誘因多為海鮮接觸史或外傷史,發(fā)病起始部位多為暴露部位或是外傷部位;皮損多表現(xiàn)為多發(fā)性,呈淋巴管樣排列模式,也可表現(xiàn)為單發(fā)性(見(jiàn)表1)。

    表1 6例皮膚分枝桿菌感染性肉芽腫患者臨床資料

    2.2 病理學(xué)檢查

    6例患者均進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,病理學(xué)結(jié)果無(wú)特異性,主要表現(xiàn)為真皮內(nèi)彌漫性混合炎細(xì)胞浸潤(rùn),包括多核巨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞等,形成肉芽腫樣結(jié)構(gòu),部分區(qū)域可見(jiàn)局灶壞死(見(jiàn)圖1a、b);GMS及PAS染色均未見(jiàn)明顯菌絲和孢子,抗酸染色未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

    2.3 病原學(xué)檢查

    6例患者皮膚組織研磨后接種于羅氏培養(yǎng)基。32℃培養(yǎng)14~28 d培養(yǎng)后,前5例可見(jiàn)黃白色濕潤(rùn)菌落生長(zhǎng)(見(jiàn)圖2a),最后1例未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。挑取菌落進(jìn)行抗酸染色后可見(jiàn)分隔狀菌絲(見(jiàn)圖2b)。菌落經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定,依次為:①海分枝桿菌;②龜分枝桿菌;③海分枝桿菌;④海分枝桿菌;⑤海分枝桿菌。

    圖1 a. 組織病理學(xué)表現(xiàn)可見(jiàn)彌漫性混合炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(HE染色×100);b. 高倍鏡下可見(jiàn)多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等(HE染色×400) 圖2 a. 皮膚組織在羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)14~28 d后,可見(jiàn)黃白色濕潤(rùn)菌落;b. 抗酸染色可見(jiàn)紅色棒狀菌絲(HE染色×1000)

    2.4 DNA微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果

    6例患者皮膚組織提取DNA后進(jìn)行DNA微陣列芯片檢測(cè),6 h后檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。前5例DNA微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)、菌株測(cè)序結(jié)果一致,并且DNA微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)率(6/6)高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法(5/6),耗時(shí)更短(見(jiàn)圖3)。

    圖3 6例患者DNA微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果:①、③~⑥號(hào)標(biāo)本為海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌;②號(hào)標(biāo)本為龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌

    2.5 治療

    6例患者均給予利福平300 mg,2次/日聯(lián)合克拉霉素250 mg,2次/日治療,3個(gè)月后6例患者皮損均消退。

    3 討 論

    近年來(lái),皮膚分枝桿菌感染的報(bào)道逐年增加,這類(lèi)疾病多與外傷[6-7]、整形外科手術(shù)[8-9]、紋身[10]、美容注射、假體填充[11]等有關(guān)。另外,免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素[12]的廣泛使用,以及艾滋病、器官移植、腫瘤、糖尿病等疾病的發(fā)病率逐年升高,重癥及播散型的分枝桿菌感染的發(fā)病率和致死率也呈逐年上升趨勢(shì)。皮膚分枝桿菌感染的病原體難以被短期清除,延誤治療可能會(huì)造成患者毀容、器官功能受限甚至是殘疾。一旦確診患者需接受長(zhǎng)療程的抗分枝桿菌治療[4],因此早期病原學(xué)檢測(cè)是治療成功的關(guān)鍵。

    傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法[13]主要包括結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)和以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢查等。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性支持結(jié)核分枝桿菌或是非典型結(jié)核分枝桿菌感染,但是不能確定致病菌種[14],同時(shí)可能存在假陽(yáng)性結(jié)果,例如接種卡介苗。組織病理學(xué)是檢測(cè)皮膚分枝桿菌感染最常規(guī)的方法,但鏡下表現(xiàn)無(wú)特異性,即使是最具代表性的結(jié)核樣肉芽腫,也難以與梅毒、肉芽腫性玫瑰痤瘡、利什曼病、真菌感染性肉芽腫相鑒別;通常需配合抗酸染色,對(duì)于檢測(cè)分枝桿菌感染,特別是少菌型,陽(yáng)性率較低,同樣也不能鑒定分枝桿菌的菌種類(lèi)型。細(xì)菌培養(yǎng)是診斷分枝桿菌性肉芽腫的“金標(biāo)準(zhǔn)”,是制定診療方案必不可少的一部分,但不同的分枝桿菌培養(yǎng)溫度有所差異,且不同的分枝桿菌培養(yǎng)所需時(shí)間也不相同,一般需要2~12周[15];分枝桿菌的培養(yǎng)耗時(shí)耗力,陽(yáng)性率低,因此傳統(tǒng)的診斷方法可能導(dǎo)致診療計(jì)劃被延誤。近年來(lái),以PCR 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)也應(yīng)用于疾病的診斷中[16],如基因序列分析以及基因組分析等,但這些技術(shù)可能存在檢測(cè)范圍有限,或試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,亦或是操作步驟繁瑣等缺陷,故而限制了其在臨床上的廣泛使用。本研究所使用的DNA微陣列芯片檢測(cè)技術(shù),操作簡(jiǎn)潔快速,整體檢測(cè)過(guò)程6~8 h即可做出診斷,并且能有同時(shí)做出17種分枝桿菌的菌種鑒定,縮短了臨床診斷過(guò)程。

    基因芯片技術(shù)始創(chuàng)于20世紀(jì)90年代,近年來(lái)DNA微陣列芯片技術(shù)逐漸用于臨床上的病原學(xué)診斷[5],可對(duì)痰液[17]、分泌物、膿液、尿液、穿刺液(胸腹水、腦脊液[18]、心包積液、關(guān)節(jié)液、膽汁)等多種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),然而目前尚未見(jiàn)該技術(shù)用于皮膚組織的病原學(xué)檢測(cè)。本研究首次使用DNA微針芯片直接對(duì)皮膚新鮮組織進(jìn)行檢查,前5例患者的檢測(cè)結(jié)果與培養(yǎng)測(cè)序結(jié)果一致,準(zhǔn)確率高,因此DNA微陣列芯片診斷技術(shù)可以作為皮膚分枝桿菌感染的早期診斷方法。此外,我們發(fā)現(xiàn)臨床上高度懷疑皮膚分枝桿菌感染的病例,其培養(yǎng)陽(yáng)性率不高。這一現(xiàn)象可能是由于患者就診前局部或系統(tǒng)抗生素的不合理使用,致使分枝桿菌感染在一定程度上得到緩解和治療,使得病原體的檢出率降低。DNA微陣列芯片檢測(cè)的靈敏度為1×103個(gè)菌/PCR反應(yīng),敏感性高,對(duì)于臨床懷疑分枝桿菌感染的病例可進(jìn)行芯片檢測(cè),有助于提高診斷陽(yáng)性率。本研究中6例患者,DNA微陣列芯片檢測(cè)出6例患者陽(yáng)性,而皮膚組織培養(yǎng)5例陽(yáng)性,因此提示DNA微陣列芯片檢測(cè)陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的培養(yǎng),但這一結(jié)果尚需大樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)。

    綜上,DNA微陣列芯片診斷技術(shù)用于皮膚分枝桿菌感染的診斷具有簡(jiǎn)潔、快速、靈敏度高等特點(diǎn),可準(zhǔn)確鑒定出常見(jiàn)的致病菌種,可為臨床早期診斷和治療提供有力的支持。但是該技術(shù)仍有缺陷,不能在檢測(cè)病原菌的同時(shí)做出藥敏檢測(cè),因此尚不能完全替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)。臨床上建議芯片檢測(cè)與傳統(tǒng)培養(yǎng)相結(jié)合,以期對(duì)皮膚分枝桿菌感染做出早期診斷,制定精準(zhǔn)的治療方案。

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