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    土槿乙酸與氟康唑聯(lián)合抗白念珠菌作用的研究

    2021-09-01 00:56:24郝小康王宇鶴徐世林李楠
    中國真菌學雜志 2021年4期
    關鍵詞:氟康唑念珠菌乙酸

    郝小康 王宇鶴 徐世林 李楠

    (1.西藏民族大學附屬醫(yī)院檢驗科,咸陽 712082;2.陜西省西電集團醫(yī)院檢驗科,西安 710077)

    白念珠菌(Candidaalbicans)是一種機會性致病酵母菌,作為侵襲性真菌感染最常見的致病菌,可在免疫功能低下的個體中引發(fā)致命感染[1]。唑類抗真菌藥物中,特別是氟康唑, 由于其療效好、毒性小,在臨床治療中應用最多。然而,伴隨著氟康唑廣泛應用于白念珠菌感染,使得白念珠菌耐藥率問題顯著增多,不利于疾病治療[2]。在臨床治療中,新型抗真菌藥物的研發(fā)總是滯后于耐藥性的增加,有效的抗真菌藥物相對較少。近年來,研究者通過使用藥物聯(lián)合來克服耐藥真菌的出現(xiàn)[3]。抗真菌藥與非抗真菌藥的聯(lián)合用藥成為研究的熱點。兩個藥物對耐藥菌株的協(xié)同作用可以通過降低真菌耐藥性和增強抗真菌藥活性的方式發(fā)生[4]。

    土槿皮,為我國特有松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮。它的主要成分是土槿酸,包含土槿甲酸、土槿乙酸 (pseudolaric acid B,PAB)等一系列二萜酸化合物,土槿甲酸的研究主要在抗早孕及腫瘤細胞的細胞毒作用方面。土槿乙酸在抗腫瘤、抗真菌、調節(jié)免疫反應等方面發(fā)揮作用[5-6],本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)土槿乙酸有抗白念珠菌及其生物膜的作用[7]。本研究擬通過棋盤式微量液基稀釋法聯(lián)合藥敏實驗,測定土槿乙酸聯(lián)合氟康唑抗白念珠菌是否有協(xié)同作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌株 臨床標本中分離的20株氟康唑敏感的白念珠菌,10株來源于痰液,10株來源于陰道分泌物。8株氟康唑耐藥的白念珠菌,5株來源于陰道分泌物,3株來源于痰液。4株光滑念珠菌、3株熱帶念珠菌、3株克柔念珠菌、3株新生隱球菌均分離自臨床。質控菌株ATCC90028、ATCC90029、ATCC10231(購自北納生物有限公司)

    主要試劑 土槿乙酸和氟康唑(Fluconazole,FLZ)均購自上海源葉生物有限公司;二甲基亞砜 ( DMSO)購自Sigma Aldrich公司;SDA培養(yǎng)基購自鄭州安圖生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco,31800-022,美國):用RPMI-1640干粉配置,每10.4 g RPMI-1640溶解于1000 mL蒸餾水,加2.0 g用NaOH調節(jié)pH為7.0±0.1,0.22 μm濾過膜過濾消毒, 4℃避光保存。

    1.2 方法

    菌懸液的配置 將凍存在-75℃的菌株接種在SDA培養(yǎng)基,念珠菌35℃培養(yǎng)24 h后及隱球菌35℃培養(yǎng)48 h后,挑取SDA上的單個菌落,接種在分裝好的5 mL的0.85%生理鹽水中,渦旋震蕩30s。使用RPMI-1640培養(yǎng)基結合牛鮑氏計數板將菌液濃度調整到(0.5~2.5)×103CFU/mL。

    微量液基稀釋法測定藥物的體外抗真菌作用 參考CLSI推薦的M27-A3方案[8]及棋盤式微量液基稀釋法[9],即每孔加入100 μL 菌懸液(0.5~2.5)×103CFU/mL后,將藥物(PAB與FLZ)分別進行倍比稀釋。氟康唑選擇行,A-H行氟康唑的濃度范圍是0.5~64 μg/mL,土槿乙酸選擇列,2~10列土槿乙酸的濃度范圍是0.25~256 μg/mL。37℃培養(yǎng)24 h后,用肉眼觀察藥物的單獨MIC和聯(lián)合作用下的MIC。重復3次,結果取平均值;若平行實驗的結果相差≥兩個濃度時,則結果無效。與空白及陰性對照孔進行比較,土槿乙酸對念珠菌屬和新生隱球菌的MIC取無菌生長的最小藥物稀釋度。把空白對照不生長、陰性對照生長當作實驗有效的前提。兩藥之間的作用包括協(xié)同作用、拮抗作用和無關作用,本研究采用部分抑制濃度指數(fractional inhibitory concentration index,F(xiàn)ICI)評價土槿乙酸與氟康唑之間的相互作用。A藥和B藥聯(lián)合應用FICI抑制濃度指數計算公式:FICI = MIC(A in combination) /MIC(A alone) + MIC(B in combination)/MIC(B alone),即FICI指數越小說明兩種藥物之間協(xié)同作用越大,當 FICI≤0.5時,兩藥的相互作用為協(xié)同作用;0.54時為拮抗作用。

    統(tǒng)計學分析 將每種藥物單用及分別聯(lián)合時 MIC 值轉換成對數后,進行配對資料的t檢驗,P<0.05時具有統(tǒng)計學差異。

    2 結 果

    檢測氟康唑對20株氟康唑敏感白念珠菌以及8株氟康唑耐藥白念珠菌的MIC范圍分別為0.5~2 μg/mL、16~64 μg/mL,土槿乙酸對氟康唑敏感白念珠菌以及氟康唑耐藥白念珠菌均具有一定的抗真菌作用,MIC范圍分別16~128 μg/mL、16~64 μg/mL。應用棋盤式微量液基稀釋法,兩藥聯(lián)合作用對20株氟康唑敏感白念珠菌以及8株氟康唑耐藥菌株的氟康唑MIC分別為0.5~2 μg/mL、0.5~1 μg/mL 。根據FICI計算公式判定,20株氟康唑敏感白念珠菌FICI>0.50,所有8株氟康唑耐藥菌株FICI<0.50,即氟康唑與槿乙酸聯(lián)合對所有氟康唑耐藥菌株顯示協(xié)同作用,對所有氟康唑敏感菌株顯示為無關作用(見表1)。其中8株氟康唑耐藥菌株FICI范圍為0.03~0.19,中位數為0.07(見表1)。土槿乙酸對8株氟康唑耐藥菌株的MIC值幾何均數從32 μg/mL降至1.19 μg/mL (t=19.00,P<0.001)、氟康唑的MIC值幾何均數從34.90 μg/mL 降至0.84 μg/mL (t=20.43,P<0.001)。

    表1 土槿乙酸與氟康唑聯(lián)合應用對20株敏感菌株和8株耐藥菌株的MIC

    Tab.1 In vitro effection of pseudolaric acid B and uconazole against 20 strains of FLZ-susceptible Candida albicans and 8 strains of FLZ-resistant Candida albicans

    表1 土槿乙酸與氟康唑聯(lián)合應用對20株敏感菌株和8株耐藥菌株的MIC

    菌株MIC(單獨)MIC(聯(lián)合)PAB/(μg·mL-1)FLZ/(μg·mL-1)PAB/(μg·mL-1)FLZ/(μg·mL-1)FICIATCC102313223211.50ATCC900283221621.50ATCC900293213212.00CA132140.51.13CA2641111.02CA3641211.03CA4641211.03CA5641111.02CA61281211.02CA7128120.50.52CA8641211.03CA9641211.03CA10641411.06

    (續(xù)表)

    土槿乙酸對非白念珠菌和新生隱球菌均具有一定的抗真菌作用,MIC范圍分別為32~128 μg/mL、64~128 μg/mL。應用棋盤式微量液基稀釋法,兩藥聯(lián)合作用對10株非白念珠菌以及3株新生隱球菌的氟康唑MIC分別為0.5~64 μg/mL、0.5~2 μg/mL 。根據FICI計算公式判定,10株非白念珠菌和3株新生隱球菌FICI>0.50,即氟康唑與槿乙酸聯(lián)合對所有非白念珠菌和新生隱球菌顯示為無關作用(見表2)。

    表2 土槿乙酸與氟康唑聯(lián)合應用對非白念珠菌和新生隱球菌的MIC

    3 討 論

    研究意義 近年來,研究者努力通過使用各種抗真菌藥物組合來克服耐藥真菌的出現(xiàn)。但是,治療費用的增加和幾種藥物不良反應的疊加使得抗真菌藥物的組合舉步維艱。而且不同的研究機構報道的各種抗真菌藥物組合的協(xié)同或拮抗作用并非一致,甚至是相互矛盾的結果。因此,目前的研究的重點已經轉移到抗真菌藥物與一些中藥有效成分或者非抗真菌藥物的組合。藥物相互間抗耐藥真菌的協(xié)同機制可以通過兩種形式,其一是克服真菌耐藥,其二是增強抗真菌活性。主要包括:①阻止真菌細胞膜上甾醇的生物的合成,升高真菌細胞膜的通透性;②減少藥物外排,特別是通過抑制外排泵基因的表達;③抑制生物膜形成;④抑制鈣調磷酸酶和熱休克蛋白90(Hsp90);⑤破壞細胞質離子穩(wěn)態(tài)[10-12]。

    結果分析 本研究中,我們主要研究土槿乙酸與氟康唑抗念珠菌及新生隱球菌的研究。在本課題組的前期研究中證實土槿乙酸有抗白念珠菌及其生物膜的作用,所以本實驗主要是將土槿乙酸與氟康唑低于MIC的濃度來確定兩種藥物的聯(lián)合效果,兩種藥物聯(lián)合所測試的20株氟康唑敏感菌株FICI范圍為0.51~2.0,氟康唑敏感菌株沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。8株氟康唑耐藥菌株FICI范圍為0.03~0.19,全部表現(xiàn)為協(xié)同作用。測試的10株非白念珠菌和3株新生隱球菌FICI>0.50,全部顯示為無關作用。

    不足之處及展望 本實驗研究了兩種藥物對 20株氟康唑敏感白念珠菌和8株氟康唑耐藥菌株的相互作用,菌株樣本相對較少。樣本編號為17的白念珠菌FICI為0.51,已經接近協(xié)同作用判斷標準的FICI值0.50。后續(xù)將針對該菌株做進一步研究。

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