白念珠菌TFP1基因與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的相關(guān)性分析

孟玲寧 劉錦燕 項(xiàng)明潔 沈瀚

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 221000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院檢驗(yàn)科，上海 200020；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑以及各種介入治療和器官移植的廣泛應(yīng)用，念珠菌病的發(fā)病率逐年增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，侵襲性念珠菌感染的患者已達(dá)到250000例/年，死亡人數(shù)約為50000例/年。發(fā)病率高達(dá)2～14/1000例[1]。目前，唑類藥物是治療白念珠菌感染的首選藥物，但近年來(lái)由于其廣泛使用，唑類藥物的耐藥率越來(lái)越高[2]，因此，探索出白念珠菌具體的耐藥機(jī)制對(duì)確定新的抗真菌治療目標(biāo)尤為重要。

白念珠菌中離子穩(wěn)態(tài)的紊亂會(huì)影響許多細(xì)胞過(guò)程,而液泡型 H+-ATPase(V-ATPase)與維持胞質(zhì)中鈣離子濃度穩(wěn)定密切相關(guān)[3]。白念珠菌TFP1基因是V-ATPase的編碼基因，研究表明TFP1在白念珠菌胞吞運(yùn)輸中起著至關(guān)重要的作用。此外，TFP1對(duì)液泡功能和白念珠菌的發(fā)病機(jī)制必不可少，使其成為新型抗真菌藥物的潛在靶點(diǎn)[4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白念珠菌TFP1基因在臨床氟康唑耐藥的白念珠菌中高表達(dá)，而白念珠菌中的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路已經(jīng)證實(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Crz1p調(diào)控RTA2基因表達(dá)而介導(dǎo)白念珠菌耐藥[5]，故本次研究旨在探索TFP1基因與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路的關(guān)系，為臨床耐藥菌株的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究中使用的30株臨床白念珠菌都來(lái)自南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科。其中第1～24株為氟康唑耐藥白念珠菌；第25～30株為氟康唑敏感白念珠菌。

1.2 主要試劑

酵母菌RNA抽提試劑盒Yeast RNAiso Kit(Takara)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT-PCR Kit(Takara)，RT-PCR擴(kuò)增試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII(Takara)均購(gòu)自于大連寶生物工程有限公司；酵母菌氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基及酵母菌高效轉(zhuǎn)染試劑盒(北京泛基諾公司)；rTaq酶、Ex Taq酶、DNA Marker DL2000和DNA Marker DL5000(大連寶生物工程有限公司)；DMT化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程有限公司)；PCR 產(chǎn)物回收試劑盒(Biomiga 公司)；鯡魚精DNA[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司]。

按配方分別配制YPD培養(yǎng)液和YPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)液、含氨芐西林的LB培養(yǎng)基以及酵母缺陷培養(yǎng)基SD-LEU2(SD培養(yǎng)基中不含亮氨酸)和SD-LEU2-HIS1(SD培養(yǎng)基中不含亮氨酸和組氨酸)。

1.3 引物

引物序列見(jiàn)表1，所有引物均在NCBI BLAST網(wǎng)站檢測(cè)其特異性，并由生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物序列

1.4 臨床菌株基因TFP1表達(dá)量檢測(cè)

挑取白念珠菌工程菌SN152單克隆菌落于3 mLYPD培養(yǎng)液中，200 r/min、 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Ep管中，按照Yeast RNAiso Kit試劑盒進(jìn)行總RNA抽提，后按照PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒說(shuō)明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。制備好的白念珠菌cDNA利用Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書配制RT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)的兩對(duì)引物18S-F/18S-R(白念珠菌18S rRNA引物)和TFP1-F/TFP1-R見(jiàn)表1，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃ 5 s，60℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 菌株DNA抽提、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抽提

參照項(xiàng)明潔等[6]方法，挑取SN152單克隆菌株于2 mL YPD液200 r/min搖16 h，收集菌體用蒸餾水清洗1遍后，加入0.5 mL lysis buffer，37℃水浴2 h后離心棄上清，利用苯酚/氯仿/異戊醇方法對(duì)菌株進(jìn)行DNA抽提。

參照王影等[7]方法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抽提，吸取5 μL質(zhì)粒pSN52、pSN40加入到配制好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，吹打混勻后低速離心數(shù)秒，置于冰上30 min；后42℃水浴熱激90 s，立即置冰上放置2 min；加入37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)液500 μL中，于搖床中37℃ 200 r/min培養(yǎng)45 min，離心2 min后棄上清300 μL，混勻Ep管中剩余液體后，均勻涂布于含卡那霉素的LB選擇性平板上，37℃孵育過(guò)夜。第2天挑取平板上的單克隆菌落至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)16 h。次日，利用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.6 等位基因敲除組件構(gòu)建

參照Noble等的方法[8]，以SN152菌株DNA為模板、 P1和P3為引物擴(kuò)增TFP1基因的上游片段up；P1’和P3’為引物擴(kuò)增TFP1基因的上游片段up’;P4和P6為引物擴(kuò)增TFP1基因的下游片段down；P4’和P6’為引物擴(kuò)增TFP1基因的下游片段down’。以pSN40和pSN52質(zhì)粒DNA為模板，P2和P5為引物分別擴(kuò)增營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記片段His1和Leu2。其中P3和P3’的5’端序列與P2的5’端序列互補(bǔ)；P4和P4’的5’端序列與P5的5’端序列互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，按照Biomiga膠回收試劑盒操作分別進(jìn)行回收。

將純化后的PCR產(chǎn)物up、His1、down按照融合PCR反應(yīng)的體系進(jìn)行配制，體系(50 μL)為0.3 μL Ex Taq酶、5 μL 10×緩沖液、4 μL dNTP、50 ng up/down片段、200 ng His1片段、0.4 μL P1、0.4 μL P6和ddH2O。反應(yīng)條件為94℃ 2 min預(yù)變性; 94℃ 30 s, 52℃ 50 s, 68℃ 8 min,共30個(gè)循環(huán)；68℃ 15 min延伸。得到的融合片段up-his1-down經(jīng)電泳鑒定后，利用乙醇沉淀法進(jìn)行回收。同樣的方法制備融合片段up’-leu2-down’。

1.7 目的基因TFP1敲除株構(gòu)建

以白念珠菌SN152為親本菌對(duì)TFP1基因先進(jìn)行第一拷貝敲除，將敲除組件up-leu2-down通過(guò)醋酸鋰方法轉(zhuǎn)染至菌株SN152，用滅菌玻璃棒將處理過(guò)的菌體均勻涂布于SD-leu2缺陷培養(yǎng)基中，置于30℃孵育2 d。挑取單克隆菌株于YPD液中200 r/min搖16 h，進(jìn)行菌株DNA抽提，后采用套式PCR方法鑒定TFP1基因是否成功敲除。引物P1 up和LEU left分別位于引物P1和P2的上游和下游，引物L(fēng)EU right和P6 down分別位于引物P5和P6的上游和下游，用以檢測(cè)同源重組片段up-leu2-down是否插入以及插入的位置是否正確。第一拷貝成功敲除后進(jìn)行第二拷貝的敲除，用同樣的方法將片段up’-his1-down’轉(zhuǎn)染至菌株TFP1+/-。敲除后采用套式PCR 鑒定片段是否成功插入相應(yīng)的位置(引物見(jiàn)表1)。再設(shè)計(jì)引物TPF1-F和TFP1-R鑒定目的基因TFP1是否被完全敲除。

1.8 菌株TFP1、CRZ1、RTA2表達(dá)量檢測(cè)

挑取單克隆菌株SN152 1株、TFP1+/-菌株5株以及TFP1-/-菌株5株分別于YPD培養(yǎng)液中搖過(guò)夜，后進(jìn)行DNA抽提。采用與1.4中相同的方法檢測(cè)各菌株中TFP1、CRZ1以及RTA2基因的表達(dá)量，四對(duì)引物見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1 臨床菌株基因TFP1表達(dá)量檢測(cè)

為了增加結(jié)果的可靠性，我們對(duì)同一份標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)3次，計(jì)算他們的均值為最終目的基因的Ct值。以氟康唑敏感的菌株△Ct均值為校準(zhǔn)值1，計(jì)算得到各臨床菌株TFP1基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖1所示，在24株臨床氟康唑耐藥或劑量-敏感依賴型菌株中有9株表現(xiàn)為TFP1基因高表達(dá)(2倍或者以上)。

圖1 30株臨床白念珠菌菌株TFP1相對(duì)表達(dá)量

2.2 等位基因敲除組件構(gòu)建

白念珠菌TFP1基因第1條同源重組基因敲除組件由up(424 bp)、leu2 (2307 bp)和down (460 bp)片段構(gòu)成；第1條同源重組基因敲除組件由up’(449 bp)、his1 (2388 bp)和down’(450 bp)片段構(gòu)成，由電泳結(jié)果圖2a和2b可以看出各基因片段大小和位置均正確。融合PCR的電泳結(jié)果(圖2c)顯示，第一拷貝敲除組件up-leu2-down和第二拷貝敲除組件up’-his1-down’片段的大小和位置均正確。

2.3 目的基因TFP1敲除株構(gòu)建

鑒定第一拷貝敲除株時(shí)，兩對(duì)引物P1 up和LEU left、LEU right和P6 down分別位于篩選標(biāo)記Leu2的上下游，長(zhǎng)度分別為1187 bp和1217 bp,電泳結(jié)果如圖3a所示，條帶大小與位置均正確，TFP1基因第一拷貝敲除成功。鑒定雙拷貝敲除株時(shí)，兩對(duì)引物P1’ up和HIS left、HIS right和P6’ down分別擴(kuò)增出篩選標(biāo)記His1的上下游，長(zhǎng)度分別為769 bp和1007 bp，電泳結(jié)果如圖3b所示，條帶大小與位置均正確。同時(shí)引物TFP1-F和TFP1-R未能擴(kuò)增出TFP1基因片段，證明雙拷貝敲除成功。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 圖3 敲除株鑒定電泳結(jié)果

2.4 菌株TFP1、CRZ1、RTA2表達(dá)量檢測(cè)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定白念珠菌SN152 1株、TFP1+/-菌株5株以及TFP1-/-菌株5株中基因TFP1、CRZ1和RTA2的表達(dá)水平。先將白念珠菌總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各目的基因的表達(dá)水平。我們以白念珠菌18S rRNA 為內(nèi)參基因，檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中各基因擴(kuò)增的Ct值，用相對(duì)定量方式計(jì)算TFP1、CRZ1和RTA2的△Ct(△Ct=CtTFP1/CRZ1/RTA2-Ct18S)，各敲除菌株TFP1、CRZ1和RTA2表達(dá)量相對(duì)于白念珠菌工程菌SN152表達(dá)量均值的倍數(shù)即為2(△△Ct=△Ct-△CtSN152)。結(jié)果如表2所示，當(dāng)白念珠菌SN152第1條等位基因TFP1敲除后，CRZ1和RTA2的表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化；當(dāng)白念珠菌兩條等位基因均敲除后，CRZ1的表達(dá)量下降了約40%，RTA2的表達(dá)量下降了約60%。

表2 白念珠菌TFP1、CRZ1和RTA2相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

離子穩(wěn)態(tài)對(duì)維持白念珠菌的生長(zhǎng)代謝極為重要，離子穩(wěn)態(tài)的失調(diào)會(huì)影響細(xì)胞過(guò)程的各個(gè)方面，其中液泡型H+-ATPase(V-ATPase)對(duì)于維持離子穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，而TFP1是V-ATPase亞基蛋白的編碼基因[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌TFP1-/-細(xì)胞對(duì)抗真菌藥物高度敏感，并且會(huì)影響胞質(zhì)中鈣離子的水平[9]。為了探究臨床白念珠菌菌株TFP1基因的表達(dá)量，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)TFP1基因進(jìn)行半定量檢測(cè)，結(jié)果顯示在24株氟康唑耐藥白念珠菌中，有9株表現(xiàn)為TFP1基因過(guò)表達(dá)，而其余菌株TFP1基因表達(dá)量相對(duì)于敏感菌株均沒(méi)有2倍以上程度的增加，我們猜測(cè)其余菌株的耐藥機(jī)制可能與鈣離子水平變化的關(guān)系較小。

白念珠菌中與鈣離子代謝相關(guān)的一條重要通路為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路CaN，已有文獻(xiàn)證實(shí)，CaN通路中調(diào)節(jié)白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥性產(chǎn)生的靶基因?yàn)镽TA2基因，而RTA2基因是CaN通路轉(zhuǎn)錄因子Crz1p調(diào)控的靶基因[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白念珠菌敲除一條等位基因TFP1時(shí)，CRZ1和RTA2的表達(dá)量分別為1.07±0.06和1.01±0.04，與親本株的表達(dá)量幾乎沒(méi)有變化；當(dāng)白念珠菌敲除全部?jī)蓷lTFP1基因后，CRZ1和RTA2的表達(dá)量相較于親本株出現(xiàn)了下降，分別為0.60±0.04和0.38±0.04,所以我們猜測(cè)TFP1基因與CRZ1、RTA2基因的表達(dá)呈正相關(guān)，而TFP1基因過(guò)表達(dá)的耐藥白念珠菌可能是依賴鈣調(diào)神經(jīng)磷酸通路的方式參與了耐藥性的形成，但其中具體機(jī)制尚未明確，還需進(jìn)一步研究。