老年宮頸癌HPV感染亞型及抑癌基因p53、p16、pRb表達(dá)

來正偉 王華斌 陳建亮 溫達(dá)靜 (杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，浙江 杭州 311200)

宮頸癌(CC)作為婦產(chǎn)科常見惡性腫瘤，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的應(yīng)用，該病發(fā)病率、死亡率有一定降低，但流行病學(xué)調(diào)查顯示，CC發(fā)病現(xiàn)愈發(fā)趨于年輕化〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發(fā)CC的主要原因，研究顯示，HPV感染過程分為潛伏期、亞臨床期、癥狀期、腫瘤期4個(gè)階段，而不同HPV亞型感染過程進(jìn)展各異，其中高危型HPV持續(xù)感染可能會加速CC進(jìn)展，增加預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)〔2,3〕。因此，明確老年CC患者HPV感染亞型，對指導(dǎo)早期干預(yù)意義重大。p53、p16、pRb是近年來腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，上述基因可紊亂腫瘤細(xì)胞周期，降低蛋白激酶活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，預(yù)防腫瘤細(xì)胞增殖〔4〕。陳麗等〔5〕研究顯示，尖銳濕疣HPV16/18感染患者p53、p16、pRb表達(dá)低于HPV16/18陰性患者，且p53、p16、pRb表達(dá)可預(yù)測癌變風(fēng)險(xiǎn)。由此猜測，p53、p16、pRb表達(dá)可能與老年CC患者HPV感染亞型存在一定關(guān)系，但目前相關(guān)研究較少。鑒于此，本研究通過觀察老年CC組織中抑癌基因p53、p16、pRb表達(dá)情況，分析抑癌基因p53、p16、pRb表達(dá)與老年CC患者HPV感染亞型的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧收集杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院2005年12月至2018年9月經(jīng)病理組織確診并完成治療、隨訪的140例老年HPV感染CC患者癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合《宮頸癌及癌前病變病理診斷規(guī)范》〔6〕中CC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理檢查證實(shí)；均經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)檢查提示HPV感染。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾??；合并其他惡性腫瘤；伴心肝腎等重要臟器相關(guān)疾病；合并其他宮頸疾病。140例患者年齡62～77歲，平均(69.50±2.34)歲；體重指數(shù)(BMI)17.6～24.9 kg/m2，平均(21.22±1.04)kg/m2；病理類型：鱗癌83例，腺癌32例，腺鱗癌25例；臨床分期：Ib1期21例，Ib2期53例，Ⅱa期66例；分化程度：低分化32例，中分化65例，高分化43例。本研究的實(shí)施符合倫理委員會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，患者標(biāo)本組織、臨床資料等均完整。

1.2方法

1.2.1HPV感染亞型檢測及分組 將裂解、凍存的細(xì)胞液置于室溫下溶解后，采用HPV分型檢測試劑盒分離、提取標(biāo)本組織DNA，并對標(biāo)本DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增及雜交，采用HPV擴(kuò)增分型檢測試劑盒測定HPV分型，主要包括高危型(HPV16、18、31、35、45等)、低危型(HPV6、11、30、39等)兩種；將高危型HPV感染患者納入高危型組，反之則納入低危型組。

1.2.2抑癌基因p53、p16、pRb檢測 取患者病理組織標(biāo)本，采用熒光定量PCR法測定抑癌基因p53、p16、pRb表達(dá)；PCR法檢測：將裂解、凍存的細(xì)胞液置于室溫下溶解后，先對標(biāo)本進(jìn)行兩項(xiàng)分離，提取標(biāo)本RNA并置于水箱中，沉淀、清洗后將干燥的RNA溶解并獲取對應(yīng)溶液，置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)儲存；采用紫外吸收法檢測RNA溶液純度，然后合成cDNA樣品，對合成樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系分為包括緩沖液2 μl、dNTP 0.1 μl、焦碳酸二乙酯(DEPC)水5 μl、MMLV 0.5 μl、RNA模板2 μl、上游引物0.2 μl、下游引物0.2 μl；先繪制待檢抑癌基因PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行定量PCR檢測；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：先于93℃環(huán)境下變性2 min，然后分別于93℃、55℃、72℃環(huán)境下變性1 min，設(shè)定40個(gè)循環(huán)，最后在72℃環(huán)境下延伸7 min；根據(jù)目標(biāo)基因選取對應(yīng)引物序列，取正常宮頸組織為對照，并設(shè)定各抑癌基因表達(dá)量為100，測定CC組織中p53、p16、pRb表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1老年CC患者HPV感染亞型情況 140例老年CC患者中128例(91.43%)高危型HPV感染；其中HPV16感染64例(50.00%)、HPV18感染43例(33.59%)；HPV31感染12例(9.37%)；其他9例(7.04%)。

2.2不同 HPV感染亞型老年CC患者相關(guān)基線資料比較 高危型HPV感染組抑癌基因p53、p16、pRb表達(dá)均明顯低于低危型組(P<0.05)；組間其他基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響分析 將抑癌基因p53、p16、pRb作為自變量(均為連續(xù)變量)，將老年CC患者HPV感染亞型作為因變量(1=高危型，0=低危型)，經(jīng)二元Logistic回歸分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示，抑癌基因p53、p16、pRb低表達(dá)均可能是老年CC患者高危型HPV感染的影響因素(P<0.05)。見表2。Logistic多元回歸分析：將老年CC患者HPV感染亞型作為因變量(1=高危型，0=低危型)，同時(shí)納入年齡、BMI等基線資料，建立Logistic多元回歸模型，在校正年齡、BMI等帶來的影響后，結(jié)果顯示，抑癌基因p53、p16、pRb低表達(dá)均是老年CC患者高危型HPV感染的影響因子(OR>1，P<0.05)。見表3。

表2 抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響二元Logistic回歸分析結(jié)果

表3 抑癌基因p53、p16、pRb對老年CC患者HPV感染亞型的影響Logistic多元回歸分析結(jié)果

3 討 論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HPV亞型有200多種，其中有30多種HPV亞型與CC發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系，但研究顯示，不同亞型HPV致病力存在差異〔7〕。據(jù)報(bào)道，持續(xù)性高危型HPV感染不僅會使宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生癌前病變，誘發(fā)CC，還將加速腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移〔8〕。因此，明確老年CC患者HPV感染亞型，對指導(dǎo)臨床干預(yù)尤為必要。

隨著病理組織學(xué)的深入研究，有報(bào)道指出，CC患者HPV感染亞型與癌基因表達(dá)密切相關(guān)〔9〕。p53是生物體內(nèi)重要抑癌基因，主要分為突變型、野生型2種，其中突變型基因有致癌作用，而野生型則具有抑癌作用〔10〕。野生型p53可監(jiān)視細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)情況，及時(shí)誘導(dǎo)異常DNA細(xì)胞凋亡，繼而清除有癌變傾向的細(xì)胞，發(fā)揮抑癌作用〔11〕。相關(guān)研究顯示，野生型p53基因丟失會導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞異常分化、增殖，誘發(fā)上皮細(xì)胞癌變，同時(shí)HPV感染后病毒DNA中E6會結(jié)合p53，導(dǎo)致野生型p53活性降低，繼而增強(qiáng)HPV致病力，促進(jìn)疾病發(fā)展〔12〕。G1/S是真核細(xì)胞分裂、增殖主要細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)，該點(diǎn)有多條調(diào)控途徑，可維持細(xì)胞正常分裂及增殖，其中pRb是G1/S調(diào)控中心環(huán)節(jié)〔13〕。研究顯示，HPV感染后病毒DNA中E7、CyclinD1-CDK4復(fù)合物等會競爭性結(jié)合pRb，使其磷酸化，進(jìn)而降低pRb活性，造成細(xì)胞異常分裂，加重疾病發(fā)展〔14〕。p16是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在多種細(xì)胞周期調(diào)控環(huán)節(jié)中均起到“閘”作用，據(jù)報(bào)道，p16可競爭性結(jié)合CDK4，抑制CDK4活性，預(yù)防pRb磷酸化，維持pRb調(diào)節(jié)作用，確保細(xì)胞正常分裂〔15〕。另有動物研究顯示，pRb活性與p16表達(dá)存在一定關(guān)系，pRb活性降低會負(fù)反饋刺激p16基因，導(dǎo)致p16表達(dá)異?！?6〕。

本研究結(jié)果提示高危型HPV感染老年CC患者的抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表達(dá)；抑癌基因p53、p16、pRb低表達(dá)與老年CC患者高危型HPV感染有一定關(guān)系。分析原因在于，機(jī)體細(xì)胞中致癌基因與抑癌基因相互制衡，維持細(xì)胞周期平衡性，預(yù)防腫瘤細(xì)胞生成，但當(dāng)抑癌基因p53、p16等低表達(dá)可能會導(dǎo)致致癌基因過表達(dá)，損傷細(xì)胞DNA，且可激活G1/S環(huán)節(jié)中調(diào)控蛋白，造成損傷細(xì)胞異常增殖，促使HPV生成病毒癌蛋白，繼而增強(qiáng)HPV致病力，推進(jìn)疾病發(fā)展，繼而增加高危型的感染風(fēng)險(xiǎn)〔17，18〕。但因?qū)m頸癌患者幾乎超過90%HPV感染均為高危型，故本研究結(jié)果并不能直接證實(shí)各個(gè)抑癌基因的低表達(dá)是直接導(dǎo)致老年宮頸癌患者高危型HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)因子，加之研究選取的是全部確診為宮頸癌的患者，故抑癌基因的低表達(dá)也可能是因感染導(dǎo)致，故二者之間的因果關(guān)系，還需要在未來進(jìn)一步納入其他宮頸病變及宮頸上皮內(nèi)瘤變的老年HPV感染患者進(jìn)行研究，進(jìn)一步證實(shí)二者的關(guān)系。

綜上，老年CC患者多為高危型HPV感染，且抑癌基因p53、p16、pRb多呈低表達(dá)，抑癌基因p53、p16、pRb低表達(dá)可能是老年CC患者高危型HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)因素，臨床應(yīng)據(jù)此提出針對性干預(yù)方案，以指導(dǎo)老年宮頸病變患者早期合理干預(yù)，以預(yù)防高危型HPV感染致CC的發(fā)生。