Prdx1基因敲減促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞凋亡*

王海鵬， 劉同帥， 于 群， 張佳文， 王明山△

（1青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院麻醉科，山東青島266071；2濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，山東濰坊261053；3南京醫(yī)科大學(xué)青島臨床醫(yī)學(xué)院，山東青島266071）

腦血管疾病以其高致殘率和高致死率病一直是危害我國(guó)中老年人身體健康和生活質(zhì)量的主要疾病，其中以缺血性腦卒中為主，發(fā)病比例約占70%［1］。缺血腦組織恢復(fù)血液灌注后，原有損傷可進(jìn)一步加重，稱(chēng)為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reper?fusion injury，CIRI）。目前研究表明，活性氧（reac?tive oxygen species，ROS）形成是引起腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷和死亡的重要機(jī)制之一［2-3］，過(guò)氧化還原蛋白1（peroxirodoxin 1，Prdx1）作為抗氧化蛋白超家族中的一員，在細(xì)胞內(nèi)參與ROS相關(guān)的多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗氧化和清除自由基的功能［4］。Wu等［5］研究表明，在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注及離體大腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose depriva?tion/reoxygenation，OGD/R）模擬的腦缺血再灌注損傷模型中，Prdx1表達(dá)量皆顯著上調(diào)。本項(xiàng)工作以小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建OGD/R模型模擬腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷過(guò)程，探討Prdx1基因敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的離體小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞株和主要試劑

小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。高糖、無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液及PBS磷酸緩沖液均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自BioInd；細(xì)胞增殖與毒性試劑盒（CCK-8）購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及DAPI染色液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制劑SP600125購(gòu)自MCE；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptRT reagent Kit和TB Green Premix Ex TaqII均購(gòu)自TaKaRa；riboFECT CPTrans?fection Kit、小鼠特異性siRNA及陰性對(duì)照序列片段均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜及RIPA裂解液均購(gòu)自北京索萊寶公司；ECL發(fā)光試劑盒、山羊抗兔的II抗及山羊抗鼠的II抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；兔抗小鼠Prdx1、JNK、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、cleaved cas?pase-3和β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abcam。

2 主要方法

2.1 N2a細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 在5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含有10%FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)液對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液每24 h更換1次，2 d后按1∶3比例傳代，在保證細(xì)胞達(dá)到實(shí)驗(yàn)密度并處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的狀態(tài)下，按不同實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照（control）組（常規(guī)培養(yǎng)，無(wú)操作處理）、OGD/R組（無(wú)糖培養(yǎng)液、無(wú)氧環(huán)境中行氧糖剝奪處理8 h，然后恢復(fù)常氧常糖培養(yǎng)24 h）、OGD/R+JNK抑制劑（SP600125）組（氧糖剝奪之后復(fù)糖復(fù)氧同時(shí)予10μmol/L SP600125處理，其余培養(yǎng)條件同OGD/R組）、OGD/R+陰性對(duì)照序列（siNC）組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列48 h后行OGD/R處理）、OGD/R+siPrdx1組（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siPrdx1 48 h后行OGD/R處理）和OGD/R+siPrdx1+SP600125組（在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siPrdx1且氧糖剝奪之后復(fù)糖復(fù)氧同時(shí)予10μmol/L SP600125處理，其余培養(yǎng)條件同OGD/R組）。

2.2 N2a細(xì)胞OGD/R模型的建立 OGD/R模型制備參考文獻(xiàn)［6-7］，并加以改良。根據(jù)我們的前期研究，N2a細(xì)胞在氧糖剝奪8 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h后，細(xì)胞活力顯著降低。因此，采用氧糖剝奪8 h再?gòu)?fù)糖復(fù)氧24 h的N2a細(xì)胞損傷模型進(jìn)行后續(xù)研究。選取生長(zhǎng)良好的N2a細(xì)胞，棄掉原有培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞3次，更換為無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液，置于缺氧罐內(nèi)，以5%CO2和95%N2混合氣體置換缺氧罐內(nèi)空氣，于37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)氧糖剝奪8 h。之后，取出細(xì)胞將無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液更換為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2、95%空氣、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h模擬復(fù)氧過(guò)程。

2.3 轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞 由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成Prdx1特異性siRNA及陰性對(duì)照序列，siPrdx1序列為5'-GCACCATTGCTCAGGATTA-3'。提前1 d將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在含有完全DMEM培養(yǎng)液的多孔板，使次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到30%~50%。根據(jù)riboFECT CP Transfection Kit說(shuō)明書(shū)，更換完全培養(yǎng)液為無(wú)雙抗培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染試劑分別與特異性及陰性對(duì)照siRNA混合，室溫孵育15 min后制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物并加入多孔板中，輕輕混勻。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于熒光顯微鏡下觀察是否轉(zhuǎn)染成功，并通過(guò)RT-qPCR及Western blot檢測(cè)敲減效率。

2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將100μL N2a細(xì)胞懸液以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板。在37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)處理后，每孔加10μL CCK-8溶液，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（absorbance，A），每組取6個(gè)復(fù)孔，設(shè)置無(wú)細(xì)胞空白對(duì)照孔，以正常組細(xì)胞活力為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)組?A空白組）（/A對(duì)照組?A空白組）×100%。

2.5 TUNEL染色檢測(cè)凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N2a細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)接種于12孔板，每孔細(xì)胞懸液1 mL；培養(yǎng)24 h后，分組處理細(xì)胞；棄培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌1次，加入含0.3%Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min；PBS洗滌2次，將5μL TdT酶與45μL熒光標(biāo)記液混合配制成50μL TUNEL檢測(cè)液，加入孔中，37℃避光孵育60 min；PBS洗滌3次，加入少量DAPI染色液，覆蓋住樣品，室溫放置5 min，吸除DAPI染色液，PBS洗滌3次；封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。在200倍鏡下，隨機(jī)取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)呈現(xiàn)綠色熒光的凋亡細(xì)胞，取平均值，細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)。

2.6 RT-qPCR 按照MiniBEST Universal RNA Ex?traction Kit說(shuō)明書(shū)操作提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)總RNA純度及濃度，取1μg RNA為模板，使用PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)總體系20μL，包括：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA溶液2μL，滅菌水6μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃31 s，共40個(gè)循環(huán)。Prdx1及β-actin引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Prdx1的上游引物序列為5'-CTTCTGTCATCTGGCATG?GATTAAC-3'，下游引物序列為5'-AAGACTCCATA?ATCCTGAGCAATGG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為114 bp；β-actin的上游引物序列為5'-TCAGCAAGCAGGAGTAC?GATG-3'，下游引物序列為5'-ACGCAGCTCAGTAA?CAGTCC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為81 bp。采用2?ΔΔCt法計(jì)算Prdx1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 Western blot 將待測(cè)細(xì)胞樣品加入300μL的RIPA裂解液，充分混勻，4℃冰箱裂解2 h。于4℃、16 100×g離心10 min，取上清備用。BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入I抗稀釋液4℃搖床孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育90 min；TBST洗膜3次，加入ECL試劑，曝光、顯影、定影處理。以β-actin為內(nèi)參照。所得條帶使用Perfection V19型掃描儀（Epson）掃描，通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。各指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)分析均為正態(tài)分布且方差齊，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siPrdx1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞的效率

1.1 熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染的有效性 以熒光基團(tuán)Cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，以DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察到90%以上的細(xì)胞發(fā)出明亮紅色熒光，分布均勻，表明共培養(yǎng)48 h時(shí)siRNA可以成功轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 以siPrdx1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)Prdx1的mRNA表達(dá)情況，與control組比較，轉(zhuǎn)染siNC組細(xì)胞Prdx1的mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染siPrdx1組細(xì)胞Prdx1的mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。這一結(jié)果顯示我們獲得了Prdx1基因敲減的N2a細(xì)胞。

1.3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 以siPrdx1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)Prdx1蛋白表達(dá)情況，與control組比較，轉(zhuǎn)染siNC組細(xì)胞Prdx1蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染siPrdx1組細(xì)胞Prdx1蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。這從蛋白水平進(jìn)一步證明我們獲得了Prdx1基因敲減的N2a細(xì)胞。

2 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞活力的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與control組比較，OGD/R處理組N2a細(xì)胞活力顯著降低（P<0.05）；OGD/R處理后，轉(zhuǎn)染siNC組N2a細(xì)胞活力與單純OGD/R處理組比無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染siPrdx1組N2a細(xì)胞的活力進(jìn)一步降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 1.The fluorescence images of N2a cells transfected with siRNA for 48 h.The red fluorescence represents the N2a cells that have been successfully transfected with Cy3-labeled siRNA.The blue fluorescence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50μm.圖1 siRNA轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞48 h的熒光圖片

Figure 2.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖2 RT-qPCR檢測(cè)siPrdx1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞的效率

3 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，與control組比較，OGD/R處理組凋亡N2a細(xì)胞的數(shù)目顯著增多（P<0.05）；OGD/R處理后，轉(zhuǎn)染siNC組凋亡N2a細(xì)胞的數(shù)目與單純OGD/R處理組比較無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染siPrdx1組凋亡N2a細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)一步增多（P<0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 3.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖3 Western blot檢測(cè)siPrdx1轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞的效率

Figure 4.The effect of Prdx1 gene knockdown on the viability of N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖4 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞活力的影響

4 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞JNK/cas?pase-3通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，OGD/R處理組的Prdx1、p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均顯著升高（P<0.05）；OGD/R處理后，轉(zhuǎn)染siNC組的Prdx1、p-JNK與cleaved caspase-3蛋白水平與單純OGD/R處理組比較均無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染siPrdx1組的Prdx1蛋白表達(dá)顯著降低，同時(shí)p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均進(jìn)一步升高（P<0.05），表明Prdx1基因敲減進(jìn)一步促進(jìn)了OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞中JNK和caspase-3的激活，見(jiàn)圖6。

Figure 5.The effect of Prdx1 gene knockdown on the apoptosis of N2a cells induced by OGD/R.The apoptosis of N2a cells was de?tected by TUNEL assay.The green fluorescence represents the apoptotic N2a cells stained by TUNEL.The blue fluores?cence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖5 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.The effect of Prdx1 gene knockdown on JNK/caspase-3 pathway in the N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖6 Prdx1敲減對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞JNK/caspase-3通路的影響

5 OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡與JNK/caspase-3通路的關(guān)系

TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，OGD/R處理后，應(yīng)用SP600125組凋亡N2a細(xì)胞的數(shù)目與單純OGD/R處理組比較顯著減少（P<0.05），見(jiàn)圖7A。

Western blot結(jié)果顯示，OGD/R處理后，應(yīng)用SP600125組N2a細(xì)胞中p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平與單純OGD/R處理組比較均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖7B。

6 Prdx1通過(guò)JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡

TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siPrdx1后，與單純OGD/R處理組相比，同時(shí)應(yīng)用SP600125可顯著減少凋亡N2a細(xì)胞的數(shù)目（P<0.05），見(jiàn)圖8A。

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siPrdx1后，與單純OGD/R處理組相比，同時(shí)應(yīng)用SP600125使p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖8B。

Figure 7.OGD/R-induced N2a cell apoptosis was mediated by JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was detected by TUNEL assay（scale bar=50μm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.圖7 JNK/caspase-3通路介導(dǎo)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡

討 論

腦缺血再灌注之后，氧供改善，腦組織內(nèi)活性氧自由基呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，打破了氧化與抗氧化之間的平衡，對(duì)腦組織造成不可逆損傷［8］?；钚匝踝杂苫赡芡ㄟ^(guò)直接損傷DNA、誘發(fā)生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、改變部分關(guān)鍵酶的活性以及影響核基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)等多種途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞特征，有分化為類(lèi)神經(jīng)元的潛能，易于轉(zhuǎn)染且大量表達(dá)微管蛋白，常被用作阿爾茲海默癥、神經(jīng)生長(zhǎng)及再生和神經(jīng)毒性等病理生理機(jī)制研究的對(duì)象［9］。本研究顯示，氧糖剝奪8 h后復(fù)糖復(fù)氧24 h處理的N2a細(xì)胞活力降低，凋亡數(shù)目增多，同時(shí)伴隨凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase-3表達(dá)升高，提示OGD/R模型制備成功。

Prdx1屬于典型2-Cy2 Prdx家族中的一員，在哺乳動(dòng)物各器官組織中廣泛表達(dá)，對(duì)維持體內(nèi)ROS水平發(fā)揮著重要的作用，并通過(guò)調(diào)控蛋白激酶的氧化還原狀態(tài)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［10-11］。與Wu等［5］的研究一致，Wang等［12］研究對(duì)OGD/R后大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞行蛋白表達(dá)分析，結(jié)果顯示OGD/R后Prdx1-4表達(dá)量均顯著升高。在對(duì)大鼠腦出血模型的研究中顯示，血腫周?chē)X組織Prdx1表達(dá)顯著升高，將腺相關(guān)病毒Prdx1表達(dá)載體注射到大鼠紋狀體3周后，構(gòu)建腦出血模型，顯示Prdx1過(guò)表達(dá)后血腫周?chē)X組織Bcl-2/Bax增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，表明Prdx1與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染siPrdx1，表明抑制Prdx1表達(dá)使OGD/R處理后的N2a細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，并加劇了細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示Prdx1可能對(duì)保護(hù)OGD/R后的N2a細(xì)胞起著重要的作用。本研究進(jìn)一步探討Prdx1基因敲減促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

Figure 8.Prdx1 affected OGD/R-induced N2a cell apoptosis through JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was de?tected by TUNEL assay（scale bar=50μm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/R group；△P<0.05 vs OGD/R+siPrdx1 group.圖8 Prdx1通過(guò)JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡

JNK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)維持、骨架構(gòu)建、凋亡、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過(guò)程［14］。MCAO和OGD/R損傷條件下均可上調(diào)神經(jīng)元p-JNK與cleaved caspase-3的表達(dá)水平［15-16］。本研究同樣檢測(cè)到OGD/R處理能夠誘導(dǎo)N2a細(xì)胞p-JNK與cleaved caspase-3表達(dá)水平升高。Lv等［17］研究表明，在小鼠急性肺損傷模型中，Prdx1基因敲除可通過(guò)提高ROS水平加重氧化應(yīng)激和肺損傷，并激活JNK信號(hào)通路。由此，我們推測(cè)Prdx1對(duì)JNK信號(hào)通路存在某種調(diào)控關(guān)系，本研究結(jié)果顯示，Prdx1基因敲減可顯著上調(diào)OGD/R處理后N2a細(xì)胞中p-JNK與cleaved caspase-3的表達(dá)水平，這表明Prdx1基因敲減促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡可能與JNK/caspase-3通路活性進(jìn)一步激活有關(guān)。

SP600125是一種小分子JNK抑制劑，可有效阻斷JNK信號(hào)通路的激活［18］。為進(jìn)一步驗(yàn)證JNK激活是否為Prdx1基因敲減促進(jìn)N2a細(xì)胞凋亡所必須的，我們應(yīng)用了SP600125，結(jié)果表明，與單獨(dú)Prdx1基因敲減組的N2a細(xì)胞相比，SP600125處理降低了N2a細(xì)胞的凋亡率以及p-JNK與cleaved caspase-3表達(dá)水平，這進(jìn)一步證實(shí)Prdx1基因敲減是通過(guò)JNK/cas?pase-3通路促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)N2a細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究表明，Prdx1可通過(guò)調(diào)控JNK/caspase-3通路影響OGD/R誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞凋亡。這進(jìn)一步支持了Prdx1可能作為一種內(nèi)源性保護(hù)因子參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程。