基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討人參治療失眠的潛在分子機制與實驗研究

2石和元丁莉

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 老年醫(yī)學(xué)研究所， 湖北 武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬黃岡中醫(yī)醫(yī)院， 湖北 黃岡 438000；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 湖北 武漢 430065)

0 引言

失眠是常見的睡眠問題，以長期不能獲得正常睡眠為主要特征。在成年人之間，有10%～15%的人群符合失眠的診斷標準，中國睡眠研究會在我國6個城市的調(diào)查報告顯示有57%的人群具有失眠的癥狀[1]。長期不能獲得正常睡眠，使得失眠患者的生活質(zhì)量下降，工作效率降低，焦慮情緒增加，同時也導(dǎo)致機體免疫、代謝等功能失常，最終產(chǎn)生一系列疾病。中藥人參在諸多治療失眠的方劑中出現(xiàn)，人參甘溫，歸肺、脾經(jīng)，具有安神的作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人參可能通過調(diào)節(jié)免疫而改善失眠癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“疾病-藥物”互作網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物對疾病的作用靶點，從整體研究藥物與疾病的關(guān)系[2]，因此，筆者選用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析人參對失眠的作用機制并以斑馬魚睡眠剝奪為失眠動物模型進行驗證。

1材料

1.1 數(shù)據(jù)庫中化合物的篩選

本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.com)，以口服利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，獲得人參的化合物活性成分。

1.2 人參化合物相對應(yīng)靶點的收集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)確認經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選所得人參中化合物的有效作用靶點。在UniProt(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中錄入經(jīng)篩選剔除相同靶點后得到的化合物-靶點并進行檢索，以“Homo sapiens”條件進一步剔除非人源及重復(fù)的靶點，得到人參活性成分的基因靶點(gene symbol)，將最終所收集的人參化合物和靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件中，建立化合物和靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 失眠相關(guān)靶點的獲取

構(gòu)建疾病數(shù)據(jù)庫時，以“insomnia”為關(guān)鍵詞，對GeneCards及TTD數(shù)據(jù)庫進行挖掘，搜集失眠相關(guān)的靶點，化合物靶點與失眠相關(guān)度的計算使用Gifts算法，然后將計算結(jié)果進行排序，選取失眠靶點的條件為得分≥30，最后將所納入的靶點的標準基因名摘錄出來。

1.4 人參對失眠的作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

基于Venny在線分析軟件，獲得人參與失眠有共同交集的靶點，進而明確人參治療失眠的作用靶點。通過利用STRING10.5平臺得到基因靶點。最后通過使用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 人參基因本體(GO)功能富集分析

通過David6.8.0數(shù)據(jù)庫對人參作用于失眠的靶點蛋白進行GO功能富集分析，具體內(nèi)容則包括生物過程、細胞組成和分子功能的功能富集分析，并將GO功能富集結(jié)果進行可視化分析。

1.6 人參KEGG通路富集分析

利用David在線平臺的KEGG富集分析功能，對人參作用于失眠的靶點中涉及的蛋白質(zhì)的功能進行了研究，共富集出14條信號通路，利用Omicshare 3.0軟件進行可視化處理。

1.7 分子對接

從人參活性成分中選取核心成分與失眠靶點蛋白GABRA1分子對接。隨后從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物結(jié)構(gòu)。DiscoveryStudio軟件用于溶劑分子和配體的去除、加氫、電子加成等操作。

1.8 實驗動物

野生型AB系斑馬魚由湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所魚房配置，房間溫度為(27±1) ℃，魚房內(nèi)光線用自動計時器設(shè)置為14 h,光照10 h,黑暗循環(huán)。本次實驗用魚采用胚胎發(fā)育到5 d的幼魚，此時期的魚可從自身卵黃囊中獲取營養(yǎng)。

1.9 藥物與試劑

藥物：人參(ginseng radix etrhizoma)購自湖北中醫(yī)藥大學(xué)黃家湖醫(yī)院，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院丁莉副教授鑒定為真品。采用純水煎煮藥物2次，濃縮至終濃度為200 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。艾司唑侖片購于中國人民解放軍中部?zhàn)區(qū)總醫(yī)院(批號：H42021522)。

試劑：RNA提取液(G3013)、RT First Strand cDNA Synthesis Kit(G3330)、2×SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)[A Synthesis Kit(G3322)]，以上試劑均由武漢Servicebio公司提供；白介素1β(IL-1β)抗體(1905101141)和γ-氨基丁酸A1(GABA)受體抗體(39925)由武漢市皮諾飛生物科技公司提供，引物使用Primer-BLAST設(shè)計。

1.10 儀器

斑馬魚行為學(xué)信號采集處理系統(tǒng)(VPLS，V-Track 3.5);96孔板(Nest Biotech,批號:701001);體視顯微鏡(PXS-1020,上海蔡康光學(xué)儀器有限公司);臺式高速冷凍型微量離心機(濟南博科，TGL-16M型)；熒光定量PCR儀(ABI，Stepone plus)；超凈工作臺(濟南博科，BBS-SDC型)；超微量分光光度計(Thermo，Multiskan SkyHigh)；DYCZ-40K型電泳儀;DYCZ-24D型電泳槽;WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 造模及分組

選取受精后5 d發(fā)育正常的幼魚，分組及處理。

空白組：正常飼養(yǎng)24 h未處理；

模型組：用200 μmol/L的咖啡因持續(xù)處理24 h；

人參治療組：在模型組的基礎(chǔ)上，用不同劑量的人參水煎液給樣處理24 h；

艾司唑侖治療組：模型組基礎(chǔ)上，用艾司唑侖片水溶液處理24 h。

2.2 斑馬魚藥物最大耐受度(MTC)

人參水煎液給藥濃度的確定按照動物藥物毒理學(xué)[3- 4]，確定使用藥物最大耐受度( MTC)，即藥物不引起實驗動物死亡的最大劑量，隨機選取240尾5dpf斑馬魚，參考《中華人民共和國藥典(2020版)第一部》人參用藥劑量及斑馬魚與人體的藥物/體重比例設(shè)置人參水煎液濃度梯度為1、2、4、8、16、32、64 mg/mL，共7組，每組40尾，處理24 h后觀察各組死亡情況。艾司唑侖片藥物最大耐受度參考本實驗室前期數(shù)據(jù)[5]，為0.05 mg/mL。

2.3 人參水煎液對斑馬魚睡眠剝奪模型行為學(xué)的影響

運用斑馬魚行為分析系統(tǒng)對斑馬魚在黑暗環(huán)境下的運動軌跡進行監(jiān)測。

2.4 人參水煎液對斑馬魚睡眠剝奪模型的睡眠改善作用和鎮(zhèn)靜作用

實驗結(jié)束后，各組分別隨機選取斑馬魚12尾，使用斑馬魚行為學(xué)信號采集處理系統(tǒng)定量分析斑馬魚的睡眠改善率及鎮(zhèn)靜作用，其計算公式[6]如下：

式中,SIR表示睡眠改善率；T1、T2、T3分別為模型組、藥物組、空白組的靜息時間；SE表示鎮(zhèn)靜作用；D1、D2、D3分別為模型組、藥物組、空白組的運動距離。靜息時間和運動距離的行為學(xué)數(shù)據(jù)采集時間均為24 h。

2.5 RT-PCR檢測GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A mRNA表達水平

各組取斑馬魚30尾，提取組織總RNA，擴增生成cDNA。設(shè)置PCR儀反應(yīng)條件：95 ℃、3 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)，測定GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A的基因表達量，用2-ΔΔCt表示mRNA相對表達水平，各個指標的引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western bolt檢測GABRA1、IL-1β的表達水平

取冰凍處死的斑馬魚40尾，用PBS洗3次，加RIAP裂解液充分裂解，加入甲醇和Loading buffer，在沸水中煮10 min，使之變性；配置10%分離膠，每孔上樣40 μg，80 V條件下電泳，至條帶達到玻璃板底部時結(jié)束電泳，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置TBST室溫封閉1 h，洗膜后將膜置于GABRA1、IL-1β抗體稀釋液(1∶1 000)中，并置4 ℃冰箱孵育過夜，用PBST洗滌3次,每次5 min；洗膜后將PVDF膜置稀釋后的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h；向膜上滴加適量ECL顯色液，置凝膠成像儀曝光各組條帶值；應(yīng)用ImageJ計算各條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 人參活性化合物的篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，以藥物標準OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，共獲得人參的化合物共22個?；衔锇ǘ圭薮?stigmasterol)、人參二醇(panaxadiol)、人參皂甙Rg5_qt(ginsenoside Rg5_qt)等，各個活性成分的OB與DL值見表2。

表2 人參化學(xué)成分Tab.2 Chemical composition of ginseng

3.2 人參化合物和靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

為了直觀地描述化合物分子與靶點之間的關(guān)系，將所納入的蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，然后將非人類蛋白和重復(fù)的化合物成分靶點掉剔除，最終構(gòu)建出“藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)”，共得到16個化合物節(jié)點和77個靶點節(jié)點。如圖1所示。

圖1 藥物-化合物成分-靶點的可視化關(guān)系圖Fig.1 Visualization of the relationship between the targets of action of drug and compound components

3.3 人參對失眠的作用靶點

以“insomnia”為關(guān)鍵詞，對GeneCards及TTD數(shù)據(jù)庫進行挖掘，從GeneCards數(shù)據(jù)庫中共獲得疾病靶點2 563個，并按Gifts算法計算取其排名前300個；TTD數(shù)據(jù)庫中獲得22個疾病靶點，共搜集疾病靶點300個，基于Venn分析工具，將疾病靶點與人參化學(xué)成分靶點進行對比分析，得出人參成分靶點與失眠相關(guān)的13個靶點基因。如圖2所示。

3.4 人參對失眠的作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為直觀反應(yīng)人參對失眠作用的潛在靶點的關(guān)系，對其進行可視化處理，通過Cytoscape軟件，將人參與失眠相關(guān)的13個潛在靶點導(dǎo)入，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。由圖3可知，這13個靶點是人參作用和失眠機制的重合靶點，其中與IL-1β關(guān)系最為密切，說明人參可能通過干預(yù)這個靶點治療失眠疾患。

圖3 人參對失眠作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of protein interactions of the targets of ginseng action on insomnia

3.5 人參對失眠作用靶點GO功能富集注釋分析

為進一步探究人參中化合物靶點的基因功能，基于David數(shù)據(jù)庫對其進行GO功能富集分析，共獲得22個生物過程(BP)，11個細胞組成(CC)，7個分子功能(MF)。利用GraphPad軟件，制作人參PPI網(wǎng)絡(luò)的GO功能富集生物過程柱狀圖，如圖4所示。

圖4 人參對失眠作用靶點的GO功能分析生物過程Fig.4 Histogram of the biological process of GO functional analysis of ginseng’s action targets on insomnia

3.6 人參對失眠作用靶點KEGG通路富集分析

利用David數(shù)據(jù)庫對人參的靶點在信號通路中作用進行KEGG通路富集分析功能，共得出14條信號通路，包括鈣信號通路。利用omicshare平臺做出氣泡圖，如圖5所示。

圖5 人參對失眠作用靶點GO分析可視化結(jié)果Fig.5 Visualization results of GO analysis of ginseng’s action targets on insomnia

3.7 人參核心成分與失眠靶點分子對接

選取人參核心化學(xué)成分Celabenzine、ginsenoside rh2與失眠靶點分子GABRA1對接，Celabenzine對接分數(shù)為61.025，Ginsenoside rh2對接分數(shù)為88.29，結(jié)果如圖6所示。

(a) Celabenzine

(b) ginsenoside rh2

圖7 人參水煎液濃度與斑馬魚生存率關(guān)系Fig.7 Relationship between the concentration of ginseng aqueous decoction and the survival rate of zebrafish

3.8 人參水煎液MTC的確定

根據(jù)2.2實驗方法處理24 h后觀察各組斑馬魚存活率，再次進行濃度篩選，最終確定人參水煎液的MTC為0.8 mg/mL，并以此劑量作為高劑量組，以1/3MTC為中劑量組，1/9MTC為低劑量組。根據(jù)人參水煎液MTC濃度探索實驗繪制的生存率關(guān)系曲線如圖7。

3.9 人參對斑馬魚睡眠剝奪模型行為學(xué)的影響

根據(jù)斑馬魚行為學(xué)追蹤系統(tǒng)結(jié)果顯示，斑馬魚運動軌跡以中運動為主(淺灰色，4～20 mm/s)，夾有小運動(黑色，<4 mm/s)和大運動(深灰色，>20 mm/s)，斑馬魚運動軌跡如圖8所示。

圖8 不同組斑馬魚運動軌跡Fig.8 Movement trajectories of zebrafish in different groups

持續(xù)給藥24 h后，各組斑馬魚靜息時間與運動距離均發(fā)生改變，靜息時間：與空白組相比，模型組靜息時間明顯減少(P<0.01)，與模型組相比，人參中劑量組、艾司唑侖組靜息時間明顯增多(P<0.01)，人參高劑量組、低劑量組靜息時間未見明顯變化(P>0.05)；運動距離：與空白組相比，模型組運動距離明顯增多(P<0.01)，與模型組相比，人參中劑量組、艾司唑侖組運動距離顯著減少(P<0.01)，人參高劑量組、低劑量組運動距離未見明顯變化(P>0.05)，人參中劑量組運動距離與艾司唑侖相比未見明顯差異(P>0.05)。如圖9所示。

(a) 靜息時間

(b) 運動距離

3.10 人參對斑馬魚睡眠剝奪模型的睡眠改善作用和鎮(zhèn)靜作用

在觀察的時間(86 400 s)內(nèi),斑馬魚睡眠剝奪模型靜息時間(61 891.300±805.207) s高于正常對照組(84 297.233±851.846) s,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各組睡眠改善情況及鎮(zhèn)靜作用見表3。

表3 人參水煎液對斑馬魚睡眠改善作用及鎮(zhèn)靜作用Tab.3 Improvement of sleep and sedative effect of ginseng aqueous decoction on zebrafish (n=12)

3.11 人參水煎液對GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A和HTR3A mRNA相對表達水平的影響

與空白組比較，模型組GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A和HTR3A表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，人參中、低劑量、艾司唑侖組的GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A和HTR3A表達均升高(P<0.01，P<0.05)，人參中劑量與艾司唑侖組、人參高劑量與模型組之間比較無差異(P>0.05)，結(jié)果見表4。

表4 人參水煎液對GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A表達的影響Tab.4 Effect of ginseng aqueous decoction on the expression of GABRA1, IL-1β, HMOX1, HTR2A and HTR3A

表4 人參水煎液對GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A表達的影響Tab.4 Effect of ginseng aqueous decoction on the expression of GABRA1, IL-1β, HMOX1, HTR2A and HTR3A

組別GABRA1IL-1βHMOX1HTR2AHTR3A空白2.23±0.171.37±0.071.51±0.051.00±0.121.05±0.08模型0.98±0.081)0.85±0.021)0.92±0.021)0.37±0.011)0.36±0.021)人參高劑量組1.01±0.127)0.88±0.017)0.95±0.017)0.40±0.037)0.40±0.027)人參中劑量組2.31±0.212)4)1.31±0.092)4)1.64±0.542)4)1.03±0.092)4)1.26±0.102)4)人參低劑量組1.21±0.106)1.03±0.044)1.19±0.167)0.51±0.037)0.41±0.037)艾司唑侖組2.27±0.203)5)1.36±0.093)5)1.69±0.473)5)1.07±0.093)5)1.09±0.093)5)

注：與空白組比較，1)P<0.01，2)P>0.05，3)P>0.05；與模型組比較，4)P<0.01，5)P<0.01，6)P<0.05；7)P>0.05。

3.12 人參水煎液對GABRA1、IL-1β蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組各指標表達明顯降低(P<0.05)，人參中、低劑量、艾司唑侖組的蛋白表達量均升高(P<0.05)，人參中劑量與艾司唑侖組，人參高劑量與模型組之間比較無差異(P>0.05)如圖10所示。

4 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對人參的22個化學(xué)成分及其靶點通路進行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。本次實驗驗證了GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A5個指標，此5個指標均可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)富集信息得到。GABRA1為γ-氨基丁酸(GABA)A型受體α1亞單位，作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)受體，對失眠起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為失眠與免疫調(diào)節(jié)之間具有密切聯(lián)系，IL-1β作為重要的促炎分子之一，具有調(diào)節(jié)睡眠喚醒的作用，有研究表明，圍絕經(jīng)期非器質(zhì)性睡眠障礙患者的IL-1β表達明顯升高，且隨失眠的嚴重程度呈正相關(guān)[8]，這可能與失眠時氧化應(yīng)激狀態(tài)增加有關(guān)。也有研究表明IL-1β在夜間睡眠時含量會增加，并且具有催眠作用，能不同程度地促進睡眠，這有可能是因為IL-1β影響了下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的釋放調(diào)節(jié)了睡眠[9]。HMOX1為血紅素代謝過程中的重要酶，具有抗氧化防御的作用，有研究證實，部分睡眠剝奪和長期睡眠剝奪大鼠恢復(fù)期肺組織血紅素氧合酶-1均升高[10]。HMOX1為抗氧化元件Nrf2的下游靶點，染料木素有效激活睡眠剝奪模型小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)的抗氧化元件Nrf2及其下游靶點，從而可以緩解由于睡眠剝奪模型引起的認知功能障礙[11]。有報道指出，五羥色胺(5-HT)在腹外側(cè)視前區(qū)具有促進大鼠覺醒的作用，抑制慢波睡眠和快速眼動睡眠[12]，SLC6A4作為5-HT的轉(zhuǎn)運體，將5-HT從腦突觸快速攝取到突觸前神經(jīng)元。有臨床研究證實，所有的原發(fā)性失眠患者SLC6A4基因單核苷酸多態(tài)性均與失眠具有顯著的相關(guān)性[13]。慢性的睡眠障礙會抑制SLC6A4的表達[14]。HTR2A、HTR3A作為五羥色胺受體，通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸對壓力的反應(yīng)、維持晝夜節(jié)律改善睡眠質(zhì)量[15]。以上5個指標均對失眠和治療起著重要的作用，提示人參可能通過抑制神經(jīng)炎癥、抗凋亡、抗氧化、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等多種途徑起到治療失眠的作用。且斑馬魚的行為學(xué)結(jié)果亦顯示人參具有調(diào)節(jié)睡眠剝奪斑馬魚睡眠時間和運動距離的作用。

本研究表明，人參治療失眠的機制可能是通過上調(diào)GABRA1、IL-1β、HMOX1、HTR2A、HTR3A的基因表達，驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，為深入研究人參治療失眠提供了依據(jù)。