一種犬瘟熱病毒強弱毒株鑒別PCR檢測方法的建立和初步應(yīng)用

張 可，薛姣雄，喻 嬌，唐青海※，曾繁榮，劉雪晴，隆澤檜，侯鑫軍

(1.南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南衡陽421008；2.衡陽市畜牧水產(chǎn)事務(wù)中心，湖南衡陽421008)

犬瘟熱病毒（Canine Distemper Virus，CDV）引起的犬瘟熱（Canine Distemper，CD）傳染性極高，臨床癥狀的表現(xiàn)多樣，各種年齡和性別的犬都會感染CDV，發(fā)病率高，染病的幼犬死亡率可達30%～80%[1,2]。CDV于1809年以來在世界范圍內(nèi)廣泛流行，同年由Jeneer首次報道，1905年Carre發(fā)現(xiàn)其病原為一種病毒，1951年Dedie由組織培養(yǎng)方法分離得到CDV[3,4]。犬瘟熱病毒的H基因是研究CDV變異情況的主要目的基因，H蛋白為CDV囊膜糖蛋白，具有血凝素功能，是病毒入侵宿主的重要調(diào)節(jié)蛋白，H基因變異會引起CDV的毒力變異，是最適合做CDV基因改變監(jiān)測的基因[5,6]。

免疫接種是犬瘟熱的預(yù)防控制主要手段，但曾經(jīng)出現(xiàn)過免疫后的犬也感染了CDV的情況[7]，且很多臨床檢測和分離的CDV毒株與疫苗株具有很高的同源性及親緣關(guān)系[8,9]，而弱毒疫苗是國內(nèi)外使用最為廣泛的犬瘟熱疫苗，所以建立一種能鑒別CDV強弱毒株的檢測方法至關(guān)重要。目前，能同時鑒別CDV強毒株和弱毒株的檢測方法較少，研究最廣泛的是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)[10,11]，其高效靈敏，特異性強。除了PCR技術(shù)，目前已經(jīng)被用來鑒別CDV強弱毒株的方法還有環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[12]，在60℃～65℃的條件下進行15～60分鐘左右的恒溫擴增，具有操作簡單、特異性強、產(chǎn)物易檢測等特點。

本試驗主要根據(jù)CDV強毒株與弱毒株H基因的保守區(qū)域分別設(shè)計了2對特異性引物，通過優(yōu)化PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序來探尋最優(yōu)的反應(yīng)條件，從而建立一種犬瘟熱病毒強弱毒株鑒別PCR的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株TOP-pMD19T-CDVH由南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室制備保存[13]；第一鏈cDNA合成試劑盒、HindⅢ、EcoRⅠ和ExTaq酶購自寶生物工程（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備

取5μL菌株TOP10-pMD19T-CDVH到已加有8μL氨芐青霉素的4 mL/管的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 rpm搖床中振蕩培養(yǎng)16～20 h。用Axyprep質(zhì)粒DNA小劑量提取試劑盒提取TOP10-pMD19T-CDVH的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒的酶切鑒定體系為：質(zhì)粒DNA 7μL、EcoRⅠ和HindⅢ各0.25μL、10×Buffer 2μL、ddH2O 10.5μL，酶切條件：37℃、35 min，1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測析，并測定其濃度。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已登錄的CDV基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件在CDV的H基因的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計4對特異性引物，引物信息見表1，其中，①與②為弱毒株的引物，③與④為強毒株的引物，由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.4 PCR擴增引物的篩選

利用表1中4對引物進行第一次PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA 2.0μL（10 ng/μL）、Ex-Taq 12.5μL、上下游引物各1.0μL（10μmol/L）、滅菌去離子水ddH2O 8.5μL。反應(yīng)的程序為：95℃5 min；98℃10 sec，62℃20 sec，72℃20 sec，30個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。

表1 引物信息

1.5 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

在第一次PCR擴增反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上選擇合適的引物、進一步探尋最優(yōu)的PCR引物反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，對反應(yīng)總體系（10μL、15μL、20μL、25μL）、退火溫度（72℃、68℃、62℃、56℃、50℃）、退火時間（5 s、10 s、15 s）、延伸時間（5 s、10 s、15 s）、循環(huán)次數(shù)（25、30、35、40、45）、陽性模板濃度（20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、2.5 ng/μL）以及引物濃度（12.5μmol/L、10μmol/L、7.5μmol/L、6.25μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L）進行優(yōu)化，確定最佳PCR反應(yīng)條件。

1.6 犬瘟熱病毒自然感染犬只的臨床檢測及病料采集

疑似犬瘟熱感染犬只來自衡陽某養(yǎng)犬場，臨床表現(xiàn)為有食欲減退、糞便呈水樣、流眼淚、抽搐等癥狀。抽取5只犬的血液，編號為A1、A2、A3、B1和B2，另外再采集B1的糞便，用膠體金試紙條對5只犬的血液和B1的糞便進行檢測。對犬進行解剖，觀察犬的病理情況，取出病犬的心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器備用。

1.7 PCR檢測方法的初步應(yīng)用

以A1、A2、A3、B1、B2的血液、心、肝、脾、肺、腎和腸為原料提取RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA模板。其中，以A1、A2、B1、B2的血液以及A2的心、肝、脾、肺、腎、腸為原料制備的cDNA作為臨床診斷的模板，用最優(yōu)的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：cDNA 1μL，ExTaq 10μL，上下游引物（CDV-vac-F1397-1424與CDV-vac-R1587-1615，CDV-W-F1397-1424與 CDV-W-R1728-1752）各0.5μL，滅菌去離子水ddH2O 7μL。反應(yīng)程序：95℃5 min；98℃10 sec，56℃5 sec，72℃15 sec，40個循環(huán)；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照記錄并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 陽性模板的制備與鑒定

如圖1所示，泳道2與泳道4為質(zhì)粒，泳道1與泳道3為質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，酶切結(jié)果為陽性，測得質(zhì)粒的濃度為200 ng/μL，用無菌水稀釋20倍（濃度為10 ng/μL）用于后續(xù)PCR擴增模板。

圖1 菌株TOP 10-pMD19T-CDVH質(zhì)粒及酶切檢測結(jié)果

2.2 PCR擴增引物的篩選

采用引物（CDV-vac-F1397-1424和CDV-vac-R1587-1615）、（CDV-vac-F1101-1128和CDV-vac-R1423-1445）、（CDV-W-F1103-1128和CDV-W-R1423-1443）、（CDV-W-F1397-1424和CDV-W-R1728-1752）進行第一次PCR擴增，圖2中泳道1和泳道2無特異性擴增條帶，泳道3、泳道4在250 bp-500 bp之間都擴增出了明顯的特異性條帶，可知①②號引物不能擴增出特異性條帶，③④能擴增出特異性條帶，結(jié)果與預(yù)期大小相符，且④號引物比③號引物擴增效果更好。

圖2 第一次PCR擴增

2.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

如圖3所示，四對引物的擴增結(jié)果與第一次PCR擴增時一致，20μL時擴增效果最好，但為降低試驗成本，先選擇10μL為后續(xù)所有優(yōu)化試驗的總體系，選擇④號引物作為強毒株的最優(yōu)引物，同時選擇與④號引物條帶相差更大的①號引物作為弱毒株的引物進行后續(xù)優(yōu)化試驗。圖4所示，設(shè)定的退火溫度條件下都有特異性條帶，其中泳道6，即62℃時的擴增效果最好。如圖5所示，泳道2、4、6都擴增出了特異性條帶，確定最佳退火時間為5 s。如圖6所示，泳道2和泳道4擴增出了特異性條帶，但泳道4的條帶不明顯，最終選擇泳道2的15 s為最佳延伸時間。如圖7所示，PCR循環(huán)次數(shù)越多擴增效果越好，選擇了擴增效果較好的40次為最佳循環(huán)次數(shù)。模板濃度的優(yōu)化結(jié)果顯示5 ng/μL為最佳模板濃度（圖8）。引物濃度優(yōu)化顯示，PCR擴增效果相差不大，最終選擇中間值6.25 μmol/L為后續(xù)擴增濃度（圖9）。

圖3 反應(yīng)總體系優(yōu)化

圖4 退火溫度優(yōu)化

圖5 退火時間優(yōu)化

圖6 延伸時間優(yōu)化

圖7 循環(huán)次數(shù)優(yōu)化

圖8 模板濃度優(yōu)化

最終PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系為：模板體積1μL（濃度5 ng/μL），ExTaq酶10μL，上下游引物體積各0.5μL（濃度6.25μmol/L），ddH2O 7μL；最佳反應(yīng)程序為：95℃5 min；98℃10 sec，56℃5 sec，72℃15 sec，40個循環(huán)；4℃保存。

（M2:DL1000 DNA Marker；1:引物濃度12.5μmol/L-引物④；2:引物濃度10μmol/L-引物④；3:引物濃度7.5μmol/L-引物④；4:引物濃度6.25μmol/L-引物④；5:引物濃度5μmol/L-引物④；6:引物濃度2.5μmol/L-引物④）圖9引物濃度優(yōu)化

2.4 犬瘟熱病毒自然感染犬只的臨床檢測結(jié)果

膠體金試紙條檢測結(jié)果表明，5只犬血液為CDV陽性，B1的糞便為CDV陰性（圖10）。圖11為5只犬的腹腔解剖圖，從圖中可看出這5只犬已經(jīng)處于脫水狀態(tài)，腸道空虛且腸粘膜充血，其他臟器眼觀無明顯病變。

圖10 膠體金試紙條檢測結(jié)果

圖11 A1、A2、A3、B1和B2腹腔解剖

2.5 PCR檢測方法的應(yīng)用

用上述優(yōu)化好的PCR擴增方法檢測臨床樣本，結(jié)果顯示，泳道1、泳道2、泳道3及泳道4所檢測的為A1、A2、B1及B2的血液均為CDV核酸陽性，A2的心、脾和腎都在300 bp左右處出現(xiàn)了特異性條帶，檢測結(jié)果為陽性，且為強毒株所感染，但肝、肺和腸為CDV核酸陰性（圖12）。

圖12 臨床診斷結(jié)果

3 討論

本試驗通過對CDV強弱毒株的H基因設(shè)計特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，建立了區(qū)分犬瘟熱病毒強弱毒株P(guān)CR檢測方法。所提取的強毒株模板不會與弱毒株擴增引物發(fā)生反應(yīng)；強毒株的2對引物擴增的產(chǎn)物都出現(xiàn)了特異性條帶，但引物CDV-W-R1423-1443和CDV-W-F1397-1424（引物③）所擴增的PCR產(chǎn)物都沒有引物CDV-W-F1397-1424和CDV-W-R1728-1752（引物④）擴增的效果好。由于弱毒株的引物CDV-vac-F1101-1128和 CDV-vac-R1423-1445（引物②）與強毒株的引物④的條帶大小相近，混合使用時PCR擴增結(jié)果不便區(qū)分，所以選用CDV-vac-F1397-1424和 CDV-vac-R1587-1615（引物①）作為弱毒株的引物。對反應(yīng)總體系的優(yōu)化中，雖然20μL的效果最好，從減少成本的角度，用10μL的總體系進行優(yōu)化試驗。退火溫度、退火時間、循環(huán)次數(shù)、模板濃度及引物濃度的優(yōu)化試驗中，每種優(yōu)化所設(shè)計的組別都能擴增出特異性條帶，但產(chǎn)物的亮度會有一些差異；延伸10 s時，條帶的亮度太淺，擴增效果不好，最后選擇15 s延伸時間。

以本試驗建立的CDV檢測方法對CDV感染犬只樣本進行檢測，血液樣本的PCR檢測結(jié)果與膠體金結(jié)果完全相符；A2號犬只的肝、肺和腸PCR檢測結(jié)果為CDV陰性，膠體金結(jié)果也顯示腸道內(nèi)容物為CDV陰性，由此可見，肝、肺、腸道及其內(nèi)容不適宜作為CDV檢測樣本。PCR檢測結(jié)果提示——心臟、脾臟、腎臟為CDV主要侵染器官。這些數(shù)據(jù)為CDV臨床樣本的準(zhǔn)確采集提供了依據(jù)。

綜上所述，本方法敏感性好、穩(wěn)定性好、擴增效率高，可同時檢測并區(qū)分犬瘟熱病毒的強毒株和弱毒株，為犬瘟熱病毒的有效診斷提供了技術(shù)支撐。