柱前衍生化LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中炔雌醇和依托孕烯及其藥動(dòng)學(xué)研究

陳曉茹，洪富美，2*

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221000；2 徐州立興佳正醫(yī)藥科技有限公司，徐州221009

去氧孕烯炔雌醇片主要活性成分含炔雌醇（EE）和依托孕烯（ENG）。該制劑連續(xù)用藥后依托孕烯血藥濃度穩(wěn)態(tài)為（4500±40）pg·mL-1[1]；炔雌醇血藥濃度穩(wěn)態(tài)為（410±21）pg·mL-1[2]。依托孕烯促進(jìn)炔雌醇引發(fā)的性激素結(jié)合球蛋白（HBG）增高，因而可使血內(nèi)游離睪酮降低且是選擇性最高的孕激素。目前對(duì)炔雌醇和依托孕烯等類固醇的血藥濃度進(jìn)行檢測(cè)的酶聯(lián)免疫法[3]、UPLC-MS/MS[4]及GC-MS/MS[5]柱前衍生法[6]多存在樣品制備量大，血漿用量多，基質(zhì)效干擾等問題，以及MS 源中前體離子的復(fù)雜裂解。因此很難達(dá)到檢測(cè)的較低血藥濃度的要求。本研究采用LC-MS/MS 分析方法，與其它分析方法相比有更高的選擇性和靈敏度，高通量且樣本前處理方法簡(jiǎn)單。現(xiàn)采用此法研究健康女性受試者餐后口服去氧孕烯炔雌醇片中炔雌醇與依托孕烯的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

LC-MS/MS系統(tǒng)；ExionLCTMAC液相色譜儀（AB SCIEX 公司），包括IonDriveTMTurbo VTM離子源，AC Pump 二元泵，QTRAP? 6500+質(zhì)譜檢測(cè)器，AC Autosampler 自動(dòng)進(jìn)樣器；MSA6.6S-0CE-DM 分析天平、BSA623S 分析天平（Sartorius 公司）；DC200H超聲波清洗器（Delta 公司）；DMT-2500 多試管渦旋混合儀（米歐儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

炔雌醇對(duì)照品（EE，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100052-201210，純度：99.4%）；依托孕烯對(duì)照品（ENG，批號(hào)：2-JLM-19-1，純度：98%）、炔雌醇-2，4，16，16-d4（批號(hào)：1-HMA-37-1，純度：96.7%）均為TRC 公司產(chǎn)品；依托孕烯-d6（TLC 公司，批號(hào)：1147-073A4，純度：98.4%）；去氧孕烯炔雌醇片（南通聯(lián)亞藥業(yè)，批號(hào)：19108007，0.15 mg/30 μg）；去氧孕烯決雌醇片（N.V.Organon，批號(hào)：N029591，0.15 mg/30 μg）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級(jí)）；碳酸鈉、正己烷、丙酮（AR 級(jí)）；甲基叔丁基醚、丹磺酰氯（色譜級(jí)）；水為去離子水。

空白血漿來源于臨床試驗(yàn)健康志愿者剩余標(biāo)本，血漿分離后于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（Narrow Bore RR 2.1×100mm，3.5μm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液，洗液50%乙腈水溶液，梯度洗脫（0～2.6min，流動(dòng)相A%為45%；2.6～6.3min，流動(dòng)相A%為20%；6.3～7.8 min，流動(dòng)相A%為1%；7.8～9.0 min，流動(dòng)相A%為45%）；流速：0.4800 mL·min-1；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度6 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；分析時(shí)間：9.00 min。

采用正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)通道（MRM），電噴霧離子化（ESI），氣簾氣體（CUR）30 kPa，離子化溫度（TEM）700 ℃，離子源氣體1（GS1）379 kPa，離子源氣體2（GS2）414 kPa，噴霧電壓27.5 kPa。待測(cè)物參數(shù)見表1。

表1 待測(cè)物的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液的配制

以甲醇為溶劑，配制100 ng·μL-1的炔雌醇儲(chǔ)備液，加入甲醇逐級(jí)稀釋，得到1 pg·μL-1的炔雌醇儲(chǔ)備液；以甲醇為溶劑，配制100 ng·μL-1的依托孕烯儲(chǔ)備液。以50%甲醇-水為稀釋溶劑逐級(jí)稀釋至含炔雌醇和依托孕烯分別為2、50pg·mL-1，5、100pg·mL-1，10、200 pg·mL-1，20、500 pg·mL-1，50、1000 pg·mL-1，100、2000 pg·mL-1，300、6000 pg·mL-1，500、1×104pg·mL-1的混合工作溶液。以甲醇為溶劑，分別配制成100 ng·mL-1的炔雌醇和依托孕烯儲(chǔ)備液。以50%甲醇-水為稀釋溶劑，配制0.15、3 pg·μL-1的炔雌醇和依托孕烯內(nèi)標(biāo)混合工作溶液。以配制的50%乙腈和0.2%甲酸的水溶液為復(fù)溶液，以水為溶劑配制6 mg·mL-1碳酸鈉溶液，配制0.5 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液。

衍生溶液配制：以6mg·mL-1碳酸鈉溶液-0.5mg·mL-1丹黃酰氯溶液（4∶15，V/V）為稀釋溶液配制含炔雌醇100 pg·μL-1、依托孕烯1000 pg·μL-1、炔雌醇內(nèi)標(biāo)10 pg·μL-1、依托孕烯內(nèi)標(biāo)100 pg·μL-1的高濃度混合溶液，以及含炔雌醇1pg·μL-1、依托孕烯100pg·μL-1、炔雌醇內(nèi)標(biāo)10 pg·μL-1、依托孕烯內(nèi)標(biāo)100 pg·μL-1的低濃度混合溶液。

基質(zhì)溶液配制：用已配制的乙腈-甲酸復(fù)溶液為配制含有炔雌醇、依托孕烯、炔雌醇內(nèi)標(biāo)和依托孕烯內(nèi)標(biāo)的高、中、低基質(zhì)溶液，使其炔雌醇內(nèi)標(biāo)濃度均為0.02pg·μL-1，依托孕烯內(nèi)標(biāo)濃度均為0.4pg·μL-1，同時(shí)炔雌醇和依托孕烯的濃度分別為0.4、8.5 pg·μL-1，0.25、5 pg·μL-1，0.06、0.15 pg·μL-1，所有溶液均保存在冰箱內(nèi)4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品制備步驟

血漿樣品前處理：精密吸取300 μL 受試者的血漿樣品于12 mL 的玻璃試管中，加入甲醇-水（50∶50）15 μL，渦旋5 min，加入40 μL 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.15、3 pg·μL-1），渦旋混勻?？瞻讟颖炯皻埩魳颖炯尤爰状?水（50∶50）40 μL，渦旋混勻，加入正己烷-甲基叔丁基醚（50∶50）3 mL，渦旋2 min 混勻，于3000 r·min-1離心5 min。取上層有機(jī)相于40 ℃條件下，以空氣氣流蒸發(fā)干燥20 min。

衍生化處理：在上述得到的血漿樣品固體物中加入8 mg·mL-1碳酸鈉溶液30 μL，渦旋2 min 混勻，再加入1 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液75 μL，渦旋2 min 混勻，水浴60 ℃保持10 min。渦旋混合1 min，于40 ℃條件下，以空氣氣流吹干。然后向其中加入300 μL 復(fù)溶液，復(fù)溶并渦旋混勻，將制備好的樣本轉(zhuǎn)移至試管中，放置在96 深孔板中備用。

2.4 臨床試驗(yàn)方案

本研究采用兩制劑（去氧孕烯炔雌醇片、Marvelon?）雙周期、交叉方式的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。20 名女性確認(rèn)為健康受試者，體重不低于45 kg，年齡18～40 周歲。受試者于給藥期間不服用葡萄柚/柚子或含此類成分的食物或飲料。試驗(yàn)期間統(tǒng)一高熱量、高脂肪飲食，每周期在餐后情況下服用2 片0.15 mg/30 μg受試制劑或參比制劑。兩次服藥間隔28 d 為清洗期。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)本校附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者自愿參加試驗(yàn)并簽署知情同意書。

給藥后4 小時(shí)內(nèi)，受試者應(yīng)意識(shí)清醒，并保持直立站姿，避免劇烈活動(dòng)。于給藥前（60 min 內(nèi)）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、6、8、12、24、36、48、72、96、125 h 由靜脈采血8 mL 于肝素化試管中，分離出血漿于冰箱-80 ℃保存待測(cè)。

2.5 專屬性考察

炔雌醇衍生物、依托孕烯及內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為5.7、2.2、5.7、2.2 min，無雜峰干擾測(cè)定。見圖1。

圖1 分析物L(fēng)C-MS 圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限（LOQ）

配制含炔雌醇濃度分別為2、5、10、20、50、100、300、500 pg·mL-1且含依托孕烯濃度分別為50、100、200、500、1000、2000、6000、1×104pg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿各300μL，在每支標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿離心管中精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.15、3pg·μL-1）40 μL，渦旋混勻。按“2.3”項(xiàng)下步驟制備樣品，計(jì)算分析物（炔雌醇衍生物和依托孕烯）和內(nèi)標(biāo)（炔雌醇-2、4、16、16-d4和依托孕烯-d6）的色譜峰面積比值。以峰面積比值對(duì)血漿中分析物的濃度（X）權(quán)重回歸計(jì)算，得到炔雌醇回歸方程Y=5.16×10-2X+1.59×10-2、r=0.9986；依托孕烯回歸方程Y=3.62×10-3X+9.44×10-4、r=0.9989，權(quán)重系數(shù)為w=1/x2。結(jié)果表明，炔雌醇在2～500 pg·mL-1、依托孕烯在50～1×104pg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法測(cè)定血漿中炔雌醇和依托孕烯的LOQ 分別為2 pg·mL-1和50 pg·mL-1。

2.7 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

配制低、中、高濃度質(zhì)控樣本：炔雌醇濃度分別為2、6、40、250、400 pg·mL-1且依托孕烯濃度分別為50、150、800、5000、8500 pg·mL-1的混合質(zhì)控樣本。上述樣本按“2.3”項(xiàng)下步驟制備樣品，測(cè)定3 個(gè)分析批。每批包含定量下限，低、中、高濃度質(zhì)控樣品（每個(gè)濃度有6 個(gè)平行樣本），一組標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，一個(gè)零濃度樣本（空白樣品只添加內(nèi)標(biāo)物無分析物），一個(gè)空白樣本。結(jié)果表明，炔雌醇和依托孕烯批內(nèi)精密度最大值分別為6.7%和4.9%（不包含LOQ），批間精密度最大值分別為5.0%和5.2%（不包含LOQ）。LOQ質(zhì)控樣品的批內(nèi)精密度分別為6.7%和8.2%，批間精密度分別為8.5%和6.0%。炔雌醇與依托孕烯批內(nèi)準(zhǔn)確度分別為-4.9%～1%、-5.2%～1.9%（不包含LOQ），批間準(zhǔn)確度分別為-2.7%～-1.5%、-4.2%～-2.1%（不包含LOQ）。LLOQ 質(zhì)控樣本的批內(nèi)準(zhǔn)確度分別為5%、-2.6%，批間準(zhǔn)確度分別為0.6%、1.0%。見表2～5。

表2 LC-MS/MS 法測(cè)定炔雌醇批內(nèi)準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=6）

表2 LC-MS/MS 法測(cè)定炔雌醇批內(nèi)準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=6）

表3 LC-MS/MS 法測(cè)定炔雌醇批間準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=3）

表3 LC-MS/MS 法測(cè)定炔雌醇批間準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=3）

表4 LC-MS/MS 法測(cè)定依托孕烯批內(nèi)準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=6）

表4 LC-MS/MS 法測(cè)定依托孕烯批內(nèi)準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=6）

表5 LC-MS/MS 法測(cè)定依托孕烯批間準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=3）

表5 LC-MS/MS 法測(cè)定依托孕烯批間準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（，n=3）

2.8 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估及提取回收率

2.8.1 基質(zhì)效應(yīng)考察配制低、中、高（炔雌醇濃度為6、250、400 pg·mL-1）濃度的6 個(gè)不同來源的空白血漿，即形成含生物基質(zhì)的樣本；以純水為基質(zhì)，且按“2.3”項(xiàng)下步驟制備，以“2.2”項(xiàng)下制備的低、中、高濃度的基質(zhì)溶液代替“2.3”項(xiàng)中的復(fù)溶液，配制成與生物基質(zhì)濃度相同的樣本，即不含生物基質(zhì)的樣本；依托孕烯（濃度為150、5000、8500pg·mL-1）的空白基質(zhì)檢測(cè)同炔雌醇。

配制加入5%經(jīng)凍融后血細(xì)胞破裂的全血的溶血樣本，以溶血樣本制備低、高（炔雌醇濃度6、400 pg·mL-1、依托孕烯濃度為150、8500 pg·mL-1）濃度的質(zhì)控樣本，每個(gè)濃度平行5 個(gè)樣本，并與分析批一同制備與分析，計(jì)算各自的平均濃度與理論值；加入2%脂肪乳注射劑的高血脂樣本，5 個(gè)以高血脂空白樣本配制與溶血樣本濃度相同的低、高濃度樣本，并與分析批一同制備與分析，計(jì)算各自的平均濃度與理論值。結(jié)果表明，炔雌醇和依托孕烯無明顯空白基質(zhì)效應(yīng)，溶血基質(zhì)效應(yīng)，高血脂基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表6。

表6 基質(zhì)效應(yīng)（，n=5）

表6 基質(zhì)效應(yīng)（，n=5）

2.8.2 提取回收率按“2.3”項(xiàng)下步驟制備低、中、高（炔雌醇濃度分別為6、250、400 pg·mL-1；依托孕烯濃度分別為150、800、8500 pg·mL-1的混合質(zhì)控樣本）濃度樣本，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液，每個(gè)濃度平行4個(gè)樣本，即為制備后樣本。將空白血漿樣本按照“2.3”項(xiàng)下步驟制備，以“2.2”項(xiàng)的低、中、高濃度的基質(zhì)溶液代替“2.3”下的復(fù)溶液進(jìn)行制備，每個(gè)濃度平行4 個(gè)樣本，即為非制備后樣本。將上述樣本分析評(píng)價(jià)，計(jì)算每一種濃度及每一種化合物制備后的樣本平均響應(yīng)值/非制備后樣本的平均響應(yīng)值×100%，考察提取回收率。提取回收率的CV≤15%與提取總回收率符合要求，結(jié)果見表6。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制中、高（炔雌醇濃度分別為6、400 pg·mL-1，依托孕烯濃度分別為150、8500 pg·mL-1的混合質(zhì)控樣本）濃度質(zhì)控樣本若干份，其中3 份按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，立即測(cè)定；另取3 份在室溫放置25h，結(jié)果平均準(zhǔn)確度偏差為7.6%、-4.5%、-1.6%、-6.2%，CV分別為6.2%、3.3%、7.1%、5.4%；3 份制備后樣品的穩(wěn)定性測(cè)試，在自動(dòng)進(jìn)樣器6 ℃下放置33 h（炔雌醇），67 h（依托孕烯），結(jié)果平均準(zhǔn)確度偏差為-3.5%、-9.0%、-5.7%、-4.6%，CV 為6.4%、3.3%、6.5%、4.9%；3 份樣本做冷凍與解凍穩(wěn)定性測(cè)試，在冰箱-20 ℃、-80 ℃冷凍與解凍5 個(gè)循環(huán)，結(jié)果穩(wěn)定?；|(zhì)中分析物在冰箱（理論-80 ℃）下放置0、32、63、98 d穩(wěn)定。

2.10 藥動(dòng)學(xué)應(yīng)用

將建立的并經(jīng)過完整方法學(xué)驗(yàn)證檢測(cè)的分析方法應(yīng)用于臨床血漿樣本的分析。作隨機(jī)、開放、單中心、單劑量、交叉實(shí)驗(yàn)，給予20 名中國健康女性受試者餐后使用去氧孕烯炔雌醇片（每片含去氧孕烯0.15 mg、炔雌醇30 μg），按照不同時(shí)間點(diǎn)采集血漿，得到炔雌醇tmax、依托孕烯tmax，兩成分AUC0-t見表7。此數(shù)據(jù)與國外已上市同品種、同劑量的去氧孕烯炔雌醇片Marvelon 的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果具有一致性，見表7；平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

表7 本研究與Marvelon?的炔雌醇與去氧孕烯主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

圖2 平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖

3 討論

本研究采用丹磺酰氯柱前衍生法提高炔雌醇分析信號(hào)，炔雌醇是苯酚羥基反應(yīng)在丹磺酰氯的仲胺部分通過親核芳族取代而衍生，丹磺酰氯與酚羥基，伯胺和仲胺反應(yīng)，炔雌醇的電離能力低且核心結(jié)構(gòu)不完整，因此丹磺酰氯的衍生化過程會(huì)產(chǎn)生仲氮基團(tuán)，使分子易于被電離。調(diào)節(jié)質(zhì)譜參數(shù)找到前體離子及子離子，且分析時(shí)基本無內(nèi)源性干擾，經(jīng)過一次液液萃取同時(shí)定量?jī)煞N藥物的濃度，分析臨床受試者的平均血藥濃具有一致性。

柱前衍生化可較好地改善藥物濃度低、信號(hào)差的問題[7]，可以定量極低濃度的炔雌醇及依托孕烯。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH>8 時(shí)進(jìn)行衍生反應(yīng)，用復(fù)溶液進(jìn)行稀釋，調(diào)節(jié)有機(jī)相比例，避免了溶劑效應(yīng)，流動(dòng)相為甲酸水溶液、甲酸乙腈溶液，調(diào)節(jié)不同的洗脫梯度，將洗脫梯度拉長使保留時(shí)間后移就可達(dá)到較好的洗脫效果。由于定量下限極低，對(duì)樣本制備環(huán)境的要求較為關(guān)鍵，改變以往的蛋白沉淀法，采用液液萃取法減少時(shí)間成本且得到較為純凈的生物樣本。