MALDI-TOF MS對(duì)臨床侵襲性絲狀真菌的快速鑒定技術(shù)的研究

張景 姜斌 彭娜 歐陽鵬文 徐文 寧興旺 劉瓊 謝良伊

[1.湖南省人民醫(yī)院(湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院)檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410005；2.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，長(zhǎng)沙 410007]

侵襲性絲狀真菌是引起免疫功能不全或有基礎(chǔ)疾病的患者呼吸道感染和死亡的重要原因，且具有病情危重、發(fā)展迅速、臨床預(yù)后差以及病死率高等特點(diǎn)，應(yīng)引起高度重視[1]。傳統(tǒng)絲狀真菌鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)的觀察，有時(shí)難以得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種非常重要的病原微生物鑒定的新方法[2]，除了有較高的準(zhǔn)確性外，其最大優(yōu)點(diǎn)是能在很短時(shí)間內(nèi)完成病原微生物的鑒定，具有操作簡(jiǎn)便、鑒定迅速、準(zhǔn)確率高和成本低的特點(diǎn)，近年來開始用于細(xì)菌、酵母菌及絲狀真菌的鑒定，可替代常規(guī)鑒定方法，降低周轉(zhuǎn)時(shí)間[3-4]。

本文對(duì)從臨床患者分離了91株常見絲狀真菌，用MALDI-TOF MS和傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法同時(shí)進(jìn)行鑒定，采用分子測(cè)序方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，驗(yàn)證質(zhì)譜技術(shù)的鑒定結(jié)果，探討質(zhì)譜技術(shù)在絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年4月—2019年7月本院各種類型臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)的65株絲狀真菌(已剔除同一患者多次送檢培養(yǎng)后所得同一種菌)，以及某三甲醫(yī)院惠贈(zèng)的26株絲狀真菌，總共91株臨床常見的絲狀真菌。初步鑒定為絲狀真菌的菌株保存在菌種保存管里，將其置于-80℃冰箱冷凍保存。大腸埃希菌ATCC8739作為校準(zhǔn)和內(nèi)質(zhì)控菌株，ATCC16888黑曲霉及ATCC10106產(chǎn)黃青霉作為研究質(zhì)控菌株。

1.2 試劑與儀器

沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素)(Sabouraud gentamicin chloramph agar, SGC)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(Columbia agar+5% sheep blood, COS)(法國(guó)梅里埃生物公司)；棉藍(lán)染色液(珠海貝索生物有限公司)；VITEK MS質(zhì)譜儀、VITEK MS-CHCA基質(zhì)液、質(zhì)譜儀樣品靶板(法國(guó)梅里埃生物公司)；甲酸、乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；引物合成及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定均由上海英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 方法

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定(生物安全柜中進(jìn)行) 將菌庫(kù)中絲狀真菌在SGC平板上進(jìn)行復(fù)蘇，用封口膜封口，置于28℃及35℃孵箱中培養(yǎng)1～5 d，至絲狀真菌長(zhǎng)出后挑取單個(gè)菌落點(diǎn)種在SGC平板上，并置于28℃孵箱中培養(yǎng)1～5 d，取一清潔載玻片，在其上滴加棉藍(lán)染液1滴，然后用透明膠帶蘸取少許菌絲后貼于載玻片上，在顯微鏡下進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察鑒定，包括其菌絲、孢子的形態(tài)及產(chǎn)孢方式等，同時(shí)結(jié)合菌落生長(zhǎng)速度、形態(tài)、質(zhì)地和顏色等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

分子生物學(xué)檢測(cè) 采用SGC平板上復(fù)蘇點(diǎn)種后的臨床菌株，利用磁珠研磨煮沸法提取其DNA，以ITS1-F/ITS2-R、β-微管蛋白(F/R)為引物，將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物具體編碼為ITS1-F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS2-R：TCCTCCGCTTATTGATATGC、β-微管蛋白-F：AATTGGTGCCGCTTTCTGG、β-微管蛋白-R：AGTTGTCGGGACGGAATAG。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳后產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)比對(duì)，確定絲狀真菌種類。

絲狀真菌質(zhì)譜鑒定 在生物安全柜中，分別挑選點(diǎn)種在SGC平板上，于28℃和35℃兩種溫度下孵育后生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行兩種不同前處理。①質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈法”提取絲狀真菌蛋白：利用一次性200 μLTip取直徑1～2 cm的菌落，將其懸浮于75%無水乙醇中，充分震蕩混勻；將混勻后的樣本高速離心2 min，盡量吸除上清液，保留沉淀，自然干燥；在沉淀中加入40 μL70%甲酸，渦旋5～8 s；再向其混合物中加入40 μL乙腈渦旋5～8 s；將按上述實(shí)驗(yàn)所得混合物靜置5～10 min后高速離心2 min；立即在質(zhì)譜儀專用樣品靶板上加入1 μL離心后所得的上清液，待自然干燥后加1 μL基質(zhì)液覆蓋在樣品靶板上，室溫下干燥后上機(jī)檢測(cè)，判讀結(jié)果。② “磁珠研磨法”提取絲狀真菌蛋白：前面同“傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定”的前3步；向沉淀-甲酸混合物中加入等體積的0.1 mm磁珠進(jìn)行充分研磨，并震蕩混勻；再向其所得混合物中加入40 μL乙腈渦旋5～8 s；將按上述實(shí)驗(yàn)所得混合物靜置5～10 min后高速離心2 min；立即在質(zhì)譜儀專用樣品靶板上加入1 μL離心后所得的上清液，待自然風(fēng)干后加1 μL基質(zhì)液以覆蓋樣品靶板，室溫下干燥后上機(jī)檢測(cè)，判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定

91株絲狀真菌通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定后，與DNA測(cè)序結(jié)果相比，僅有74株能夠正確鑒定到種，91株能夠正確鑒定到屬。其中曲霉屬鑒定到種的正確率為87.1%(74/85)，青霉屬鑒定到種的正確率為0/4。

2.2 DNA測(cè)序

91株絲狀真菌DNA在2對(duì)引物下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其中ITS1-F/ITS2-R擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在500～700 bp，詳見圖1；而β-微管蛋白(F/R)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為200～600 bp，詳見圖2。另外，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物送至公司測(cè)序，經(jīng)結(jié)果拼接比對(duì)后進(jìn)行比對(duì)，確定菌種。

圖1 絲狀真菌基因組DNA引物為ITS1-F/ITS2-R時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 圖2 絲狀真菌基因組DNA引物為β-微管蛋白時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 兩種溫度培養(yǎng)及兩種不同蛋白提取的前處理方法對(duì)常見絲狀真菌的鑒定結(jié)果比較

在該實(shí)驗(yàn)中，探索28℃和35℃條件下培養(yǎng)的絲狀真菌在質(zhì)譜儀鑒定時(shí)的鑒定結(jié)果有無差別，將兩組樣本進(jìn)行獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量χ2=0.225，P=0.813>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，兩個(gè)溫度下培養(yǎng)絲狀真菌的正確鑒定率無明顯差異，表明在應(yīng)用質(zhì)譜儀鑒定常見絲狀真菌時(shí)培養(yǎng)溫度不影響其鑒定結(jié)果，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 91株常見絲狀真菌在兩個(gè)溫度培養(yǎng)及不同蛋白提取方法質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

在質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌時(shí)，絲狀真菌菌體蛋白的提取方法不同，其鑒定準(zhǔn)確率也不同[5]。通過“磁珠研磨法”[6]與質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”這兩種不同方法，提取絲狀真菌的蛋白，將兩組樣本進(jìn)行獨(dú)立樣本χ2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量χ2=6.71，P=0.018<0.05，提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從其絲狀真菌的正確鑒定率可知，“磁珠研磨法”提取蛋白后質(zhì)譜儀鑒定的正確率優(yōu)于質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”，兩種不同蛋白質(zhì)提取方法的數(shù)據(jù)比較見表1。

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定、質(zhì)譜儀鑒定與DNA測(cè)序鑒定結(jié)果的比較

與DNA測(cè)序結(jié)果相比，91株常見絲狀真菌通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，其鑒定到種的正確率為81.3%(74/91)；通過梅里埃質(zhì)譜儀鑒定，絲狀真菌鑒定到種的正確率為97.8%(89/91)。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 形態(tài)學(xué)和MALDI-TOF MS和DNA測(cè)序鑒定結(jié)果的比較

3 討 論

MALDI-TOF MS是目前臨床微生物鑒定領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，具有成本低、耗時(shí)短、客觀、準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)，有強(qiáng)大的鑒定能力?，F(xiàn)階段，它不僅在細(xì)菌與酵母菌檢測(cè)上得到較高的應(yīng)用，在細(xì)菌的同源性分析、耐藥性上也有一定的研究，而且在血培養(yǎng)陽性率的檢測(cè)以及鑒定上也有很好的應(yīng)用前景。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，侵襲性絲狀真菌需要在對(duì)菌落進(jìn)行預(yù)處理，提取充足的蛋白質(zhì)后才能進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。本研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)分離自臨床的91株常見絲狀真菌分離株進(jìn)行鑒定，并與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和基因測(cè)序鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值；并通過“質(zhì)譜儀推薦方法”與“磁珠研磨法”提取絲狀真菌蛋白進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)兩種方法在臨床工作的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，探索MALDI-TOF MS在鑒定絲狀真菌時(shí)的菌株前處理的方法，以及培養(yǎng)條件與鑒定結(jié)果的相關(guān)性。

本研究數(shù)據(jù)顯示，使用質(zhì)譜儀鑒定絲狀真菌時(shí)，運(yùn)用“磁珠研磨法”提取蛋白時(shí)，不管是28℃還是35℃時(shí)的鑒定結(jié)果，均無差異；而推薦方法“甲酸乙腈法”提取絲狀真菌時(shí)，其在28℃和35℃時(shí)的鑒定結(jié)果雖然稍有區(qū)別，但是28℃和35℃兩種溫度條件下培養(yǎng)的菌株鑒定正確率，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在臨床常規(guī)工作中使用質(zhì)譜儀鑒定常見絲狀真菌時(shí)，培養(yǎng)溫度不會(huì)影響其鑒定結(jié)果。絲狀真菌細(xì)胞壁的厚度為100～200 nm，具有較強(qiáng)的細(xì)胞壁韌性和穩(wěn)定性，所以一般的破壁方式難以得到較好的蛋白質(zhì)圖譜[7]。然而，Vermeulen等[8]在使用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定時(shí)，細(xì)胞裂解法得到的鑒定結(jié)果明顯優(yōu)于完整細(xì)胞法。在進(jìn)行本研究時(shí)，不斷摸索提取絲狀真菌蛋白的方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，總結(jié)使用質(zhì)譜儀推薦的“甲酸乙腈提取法”及改良的“磁珠研磨法”在提取絲狀真菌蛋白后，對(duì)絲狀真菌鑒定率的影響。

本研究中，質(zhì)譜儀推薦的“甲酸乙腈提取法”提取蛋白的操作相對(duì)簡(jiǎn)單方便，但其對(duì)絲狀真菌質(zhì)譜鑒定的正確率為90.1%(82/91)，低于“磁珠研磨法”的97.8%(89/91)；而“磁珠研磨法”的操作雖較質(zhì)譜儀推薦的方法繁瑣，但實(shí)驗(yàn)室也能常規(guī)開展，能夠充分研磨從而達(dá)到破壁效果，且提取真菌蛋白的效果較好，其正確鑒定率遠(yuǎn)高于質(zhì)譜儀推薦“甲酸乙腈提取法”。Bille等[9]則將64株曲霉菌的孢子或菌絲與甲酸乙腈預(yù)先混合在靶板上，然后進(jìn)行裂解，通過對(duì)“甲酸乙腈提取法”進(jìn)行簡(jiǎn)化后，其檢測(cè)準(zhǔn)確率可以達(dá)到86%。而Hettick等[10]對(duì)12株曲霉菌屬和5株不同的黃曲霉菌，利用磁珠破碎法進(jìn)行破壁等預(yù)處理，得到的鑒定結(jié)果表明，該方法處理后的鑒定結(jié)果可以達(dá)到菌種水平的準(zhǔn)確鑒定。此外，對(duì)12株青霉菌分析表明，該法對(duì)青霉菌鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)100%[11]。Lau等[12]采用相同磁珠破碎法對(duì)該方法進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，421株絲狀真菌正確鑒定到種和正確鑒定到屬的正確率分別達(dá)到370(88.9%)株和388(93.2%)株。本研究通過對(duì)91株臨床菌株分別進(jìn)行“甲酸乙腈提取法”和“磁珠研磨法”的預(yù)處理，其研究結(jié)果驗(yàn)證了兩種方法在提取蛋白質(zhì)的不同，并且證實(shí)了“磁珠研磨法”鑒定絲狀真菌優(yōu)于常規(guī)推薦的方法?？芍谂R床工作中，我們可以通過不斷的摸索和探究找到既方便又高效的方法應(yīng)用于臨床，提高臨床工作的效率。

在該研究中，通過MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)91株常見菌株進(jìn)行鑒定，并與DNA測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行了比較，其中有97.8%(89/91)的絲狀真菌菌株能夠正確鑒定出來，其中曲霉屬和青霉屬鑒定到種的正確率均為100%；而傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法僅有74株能夠正確鑒定到種，91株能夠正確鑒定到屬。該結(jié)果與Becker等[13]的研究結(jié)果相同，表明MALDI-TOF MS技術(shù)在對(duì)常見絲狀真菌的鑒定上有較高的應(yīng)用價(jià)值。并且質(zhì)譜技術(shù)對(duì)曲霉菌的正確鑒定率為100%(85/85)。有研究學(xué)者利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)44株曲霉屬，成功鑒定36株[14]。如果僅計(jì)算數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的菌株，則可以準(zhǔn)確鑒定100%(144/144)曲霉屬，而曲霉屬93.6%(133/144)能夠準(zhǔn)確鑒定到種[15]。本研究結(jié)果驗(yàn)證了這一結(jié)論。而對(duì)于2株鐮刀菌來說，其鑒定的正確率為0。上述結(jié)論的原因可能有：①本研究中此類菌種菌株的樣本少，無法在大數(shù)據(jù)庫(kù)中得出準(zhǔn)確的結(jié)果。②部分少見絲狀真菌在DNA測(cè)序中僅能鑒定到屬，無法確定其菌種。③該質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏此類菌種的指紋圖譜，難以得到較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。本研究中黃曲霉和米曲霉難以通過DNA測(cè)序區(qū)分開，可能與兩者間高度的同源性有關(guān)。且黃曲霉和米曲霉通過質(zhì)譜技術(shù)也難以鑒別，可能是產(chǎn)生了某種色素干擾鑒定結(jié)果，盡管可以得到蛋白質(zhì)圖譜，但是造成在蛋白質(zhì)圖譜中某些臨床菌株中缺乏特定峰值或峰數(shù)不足，即使與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，卻無法獲得準(zhǔn)確鑒定結(jié)果[5]。

綜上所述，雖然本研究中實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量及菌種種類較少，但是仍在一定程度上證實(shí)了MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)越性，說明其在臨床絲狀真菌鑒定中的應(yīng)用前景廣泛，具有快速、簡(jiǎn)單、成本低及對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較低等優(yōu)點(diǎn)。隨著蛋白提取方法的不斷改善和絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，MALDI-TOF MS技術(shù)將為臨床早期診斷和及時(shí)用藥提供快速、有力的證據(jù)。