黃文強(qiáng),張志剛,鄭 玲,辛雪梅,彭大新
(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225000;2.上海東方希望集團(tuán)上海畜牧有限公司,上海 200000)
豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種高致死性、接觸性傳染病[1-3],其發(fā)病特征以嘔吐、腹瀉、脫水、電解質(zhì)紊亂為主,各種年齡階段和不同品種的豬群都有易感性,且對哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的危害更大[4],尤其是哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重,發(fā)病率高達(dá)100%,病死率為30%~80%[5]。
PEDV的形態(tài)是典型的冠狀病毒形態(tài)[6],形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)多形性,近似于球形,病毒的外部有囊膜,囊膜上有纖突,纖突之間的間距較大,并且排列比較規(guī)范,呈花瓣樣放射狀,纖突的長度約為20 nm左右,PEDV粒子的大小為95 nm~190 nm,平均直徑為130 nm。核酸為線性單股正鏈RNA[7],其表面具有3種結(jié)構(gòu)蛋白,即纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)[8]。其中M蛋白位于PEDV的囊膜表面,是囊膜上含量最多的蛋白,在不同的PEDV毒株之間具有相對保守性,常常使用其作為建立PEDV的RT-PCR方法和流行病學(xué)的研究工具的靶基因[9]。
該病從2010年開始嚴(yán)重暴發(fā)流行,原有疫苗保護(hù)效果較差,提示可能存在變異株[10-13]。近年來PED流行范圍不斷擴(kuò)大,呈現(xiàn)地方流行性,是嚴(yán)重威脅我國和全球生豬養(yǎng)殖的重要疫病。為了進(jìn)一步研究該病原的致病性特征,加強(qiáng)對PED的防控,本研究從江蘇省某豬場發(fā)生疫情的5日齡仔豬糞便和腸道中分離1株P(guān)EDV,以期為PEDV的致病機(jī)理研究和疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。
1.1.1 病料與細(xì)胞 無菌采集江蘇某豬場5日齡腹瀉仔豬的小腸及內(nèi)容物,置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。Vero細(xì)胞為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。
1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PremixTaqTMTaKaRaTaqTMVersion 2.0)、PrimeScriptTaqTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL 2 000 DNA Marker,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素),Hyclone公司產(chǎn)品;胰酶,Gibco公司產(chǎn)品。
1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中AF353511.1序列設(shè)計擴(kuò)增PEDV M基因的引物,PEDV-F/R分別為5′-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′和5′-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATA-3′,預(yù)期擴(kuò)增長度為663 bp。豬瘟病毒(CSFV)[14]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)[15]、豬傳染性胃腸炎病毒(TEGV)、豬輪狀病毒(PRV)[16]引物序列參考已發(fā)表論文中的引物序列;所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。
1.1.4 主要儀器 生物安全柜,MVE公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測儀,Bioteck公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱,NVAIRE公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡,Olympus公司產(chǎn)品;-80℃超低溫冰箱、PCR儀,美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。
1.2.1 病料處理 將病料加入5倍體積含雙抗(青霉素100 IU/mL,鏈霉素100 μg/mL,pH7.2)的PBS溶液(pH7.2)研磨,反復(fù)凍融3次,8 000 r/min離心10 min,無菌吸取上清液,用0.22 μm濾器過濾后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 RT-PCR檢測 取1.2.1處理過的病料上清,根據(jù)TaKaRa公司RNA/DNA提取試劑盒說明書,進(jìn)行病毒RNA/DNA的提取,將提取出來的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對提取出的cDNA和DNA進(jìn)行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒的PCR鑒定,檢測體系和條件按常規(guī)檢測方法操作。
1.2.3 病毒分離 復(fù)蘇Vero細(xì)胞,將長成單層致密的Vero細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,用MEM洗3遍后按10%的接毒量加入處理好且PEDV檢測結(jié)果為陽性,其他病毒檢測結(jié)果為陰性的病料上清,37℃吸附1 h后,加入終濃度為10 μg/mL胰酶的維持液[10],置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后盲傳,同時設(shè)不加病料上清的終濃度為10 μg/mL胰酶維持液的Vero細(xì)胞作為健康對照。當(dāng)觀察到細(xì)胞病變后,采集培養(yǎng)液上清,連續(xù)傳代2次。
1.2.4 病毒含量的測定 用MEM培養(yǎng)基將毒種做10倍系列稀釋,取10-5、10-6、10-7、10-84個稀釋度,分別接種已長成良好單層的Vero細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個稀釋度接種6孔,100 μL/孔,置37℃作用1 h,棄液,加入MEM培養(yǎng)基,100 μL/孔,同時設(shè)正常細(xì)胞對照,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,每日觀察并記錄細(xì)胞病變(CPE),按Reed-Muench法計算TCID50,距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))。
1.2.5 M基因序列分析 取1 μL的TaKaRa隨機(jī)引物、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L each),加入8 μL總RNA中,置于65℃金屬浴5 min后,冰上迅速冷卻。于上述變性后反應(yīng)液中加入5×buffer 4 μL,Prime Script Ⅱ RTase (200 U/μL)反轉(zhuǎn)錄酶1 μL,RNA酶抑制劑0.5 μL,RNase Freed dH2O 4.5 μL總體積20 μL。反應(yīng)條件:42℃反轉(zhuǎn)錄1 h,95℃ 5 min后,冰上冷卻。
取上述2 μL cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR,反應(yīng)按如下體系在PCR管中進(jìn)行,2×PremixTaq25 μL,引物PEDV-F、PEDV- R各1 μL,滅菌水21 μL,總體積50 μL。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個循環(huán);最后 72℃延伸10 min。
將電泳結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物,按照TaKaRa公司的膠回收試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,純化后由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。利用DNA Star軟件進(jìn)行分析,使用Mega 7軟件對NJ方法對核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)行分析。
1.2.6 動物回歸試驗 將10頭7日齡仔豬隨機(jī)分為感染組(n=5)和對照組(n=5)。感染組每頭仔豬口服2 mL含量為106.0TCID50/mL的病毒;對照組每頭仔豬口服相同體積的PBS。接種后每日觀察仔豬臨床表現(xiàn)并記錄,對出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉或垂死的仔豬給予安樂死。
1.2.7 半數(shù)致死量試驗 將18頭7日齡仔豬隨機(jī)分為4組,第1、2、3組為試驗組,每組5頭豬;試驗組分別口服接種2 mL,病毒含量依次為104.5、105.5、106.5TCID50/mL的F6代分離株。第4組為對照組,3頭豬,每頭仔豬口服相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。接種后每日觀察仔豬臨床表現(xiàn)并記錄,連續(xù)觀察10 d。試驗結(jié)束時,統(tǒng)計各組仔豬的死亡率,按照Reed-Muench法計算其半數(shù)致死量(LD50)。
將提取的DNA及RNA進(jìn)行7種病毒(PCV2、CSFV、PRRSV、PPV、TEGV、PEDV、RV)的PCR檢測,其中1份DNA/RNA樣品成功擴(kuò)增出長度約為663 bp的目的片段(圖1)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后,送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序,測序結(jié)果表明,與GenBank上PEDV M基因同源性高達(dá)99%以上。
PEDV陽性病料接種Vero細(xì)胞后,盲傳到F4代,出現(xiàn)明顯病變,主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面粗糙,顆粒增多,有多核細(xì)胞,并可見空斑樣小區(qū),細(xì)胞脫落等病變特征(圖2A)。而對照細(xì)胞保持致密的單層,呈長梭形,輪廓清晰,細(xì)胞脫落極少(圖2B)。將分離株命名為PEDV JS14株。將PEDV JS14株連續(xù)傳代至F6代,細(xì)胞病變比較穩(wěn)定,對分離得到的F4代~F6代PEDV JS14株的病毒含量進(jìn)行測定,并使用Reed-Muench方法進(jìn)行計算,結(jié)果表明,F(xiàn)4代病毒含量為105.5TCID50/mL,F(xiàn)5代病毒含量為106.0TCID50/mL,F(xiàn)6代病毒含量為106.5TCID50/mL。
M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、3、5、7、9、11、13.分別PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的陽性對照;2、4、6、8、10、12、14.分別是以病料為DNA/cDNA進(jìn)行PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的核酸擴(kuò)增結(jié)果
A.接毒后的細(xì)胞;B.正常Vero細(xì)胞A.Vero cells after inoculation;B.Normal Vero cells
對F0代~F8代細(xì)胞培養(yǎng)物提取核酸進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖3)?;厥誔CR產(chǎn)物,送往蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將獲得的JS14株M基因序列與國內(nèi)外具有代表性的19株P(guān)EDV毒株進(jìn)行同源性比對分析,發(fā)現(xiàn)其與KF272920.1同源性最高,達(dá)到99.9%(圖4)。M基因遺傳進(jìn)化分析表明,JS14株與美國分離毒株KF272920.1屬于同一分支,具有較近的親緣關(guān)系,而與經(jīng)典毒株CV777存在一定進(jìn)化距離(圖5)。
圖4 PEDV M基因序列同源性比對
圖5 PEDV M基因遺傳進(jìn)化分析
試驗組5頭7日齡仔豬口服接種JS14株F6代10 h后,均出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀;30 h后癥狀加重,4頭仔豬死亡;42 h后剩余1頭仔豬出現(xiàn)水樣糞便、內(nèi)有凝乳樣白色和淡黃色塊狀物,被毛粗糙,仔豬消瘦明顯等癥狀。試驗期間,對照組仔豬未出現(xiàn)上述臨床癥狀。剖檢病死豬發(fā)現(xiàn),小腸擴(kuò)張,部分腸壁變薄呈透明狀有出血點,腸系膜充血顯示(圖6A~圖6D)。試驗結(jié)果表明,JS14分離株接種仔豬后,可引起PED典型的臨床癥狀,結(jié)合RT-PCR、細(xì)胞病變觀察結(jié)果,最終確定該分離毒株為PEDV強(qiáng)毒株。
M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對照;2.陽性對照;3~11.分別為F0~F8的細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸;12~17.分別為F8代細(xì)胞培養(yǎng)物的PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2鑒定
A.淡黃色嘔吐物;B.淡黃色水樣糞便;C.小腸部分腸壁變薄呈透明狀有出血點;D.腸系膜充血
將PEDV JS41株F6代病毒液口服接種7日齡人工哺乳仔豬,觀察期內(nèi),不同病毒滴度(106.5、105.5、104.5TCID50/mL)的試驗組均出現(xiàn)典型臨床癥狀,主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、水樣糞便等癥狀。接種滴度為106.5TCID50/mL的5頭仔豬全部死亡,發(fā)病率為100%,病死率為100%。接種滴度為105.5TCID50/mL的5頭仔豬中,有4頭死亡,發(fā)病率為100%,病死率為80%。接種滴度為104.5TCID50/mL的5頭仔豬中,有1頭死亡,發(fā)病率為60%,病死率為20%(表1)。Reed-Muench法計算結(jié)果表明,其半數(shù)致死量為105.0TCID50/mL。
表1 JS14株感染7日齡仔豬發(fā)病率及死亡率
本試驗通過對發(fā)病豬場10日齡內(nèi)腹瀉仔豬的糞便和病死豬小腸內(nèi)容物進(jìn)行PEDV病原的RT-PCR檢測,同時對該陽性病料進(jìn)行了外源病毒檢測(PCV2、PRRSV、CSFV、TEGV、RV、PPV)篩選出一份PEDV結(jié)果呈陽性,其他病毒檢測結(jié)果為陰性的樣品。將該陽性病料接種Vero細(xì)胞,進(jìn)行PEDV的初步分離工作。PEDV分離方面,我國報道較早的是李樹根等[17]采用添加胰酶的細(xì)胞維持液成功地將分離的PEDV適應(yīng)于Vero,并篩選出了最佳的胰酶用量。本試驗通過在維持液中加入10 μg/mL胰酶,成功的分離到了可在Vero細(xì)胞系上產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變的PEDV JS14株,該毒株在盲傳第4代時出現(xiàn)病變,提示病毒已經(jīng)適應(yīng)了Vero細(xì)胞,將PEDV JS14株連續(xù)傳代至F6代,細(xì)胞病變比較穩(wěn)定,其病毒含量達(dá)到106.5TCID50/mL。與之前分離的毒株相比,其病毒滴度高于早年間發(fā)現(xiàn)的毒株,例如:PEDV-HZ(病毒滴度為105.7TCID50/mL)、PEDV SD201604株(病毒滴度為103.5TCID50/mL)[18-19]。
本試驗對PEDV JS14株致病性進(jìn)行了初步研究,在攻毒10 h后,5頭仔豬均出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀;攻毒30 h后,3頭仔豬死亡;攻毒42 h后,剩余2頭仔豬出現(xiàn)水樣糞便、內(nèi)有凝乳樣白色和淡黃色塊狀物,被毛粗糙,仔豬消瘦明顯等癥狀,而對照組仔豬未出現(xiàn)上述臨床癥狀。與PEDV TX株相比[20],試驗動物出現(xiàn)典型癥狀時間早,病程長,發(fā)病癥狀嚴(yán)重,說明本研究分離的毒株,病毒含量高,致病性強(qiáng)。M基因的遺傳進(jìn)化樹顯示與美國分離株KF272920.1同源性最高,可能與種豬引進(jìn)的來源有關(guān),需對其他基因進(jìn)行序列分析來進(jìn)一步驗證。
綜上所述,本研究成功分離到1株豬流行性腹瀉病毒,將其命名為PEDV JS14株,并將JS14毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)。通過細(xì)胞病變、RT-PCR檢測進(jìn)行鑒定,動物回歸試驗證實為PEDV強(qiáng)毒株,為PEDV的生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究提供了參考。