布魯氏菌16M BtpA和BtpB真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在293T細(xì)胞中的表達(dá)

喬連江，楊 森，張 萍，楊艷玲

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122)

布魯氏菌病(Brucellosis)又稱布病、布氏桿菌病、馬耳他熱，是由布魯氏菌屬引起的一種常見(jiàn)的動(dòng)物疫源性傳染病，是世界上最古老的疾病之一[1-2]。布魯氏菌(Brucella)是一種微小的球狀、桿狀或球桿狀的革蘭氏陰性兼胞內(nèi)寄生菌，主要侵染單核-巨噬細(xì)胞，可引起人和多種家畜的慢性感染[3-4]。根據(jù)主要宿主的特異性、生化特性和抗原成分，把布魯氏菌屬分為10個(gè)種19個(gè)生物型，目前以羊種、牛種、豬種對(duì)人類和家畜的危害性最強(qiáng)[5]。人患病后多表現(xiàn)為大汗、反復(fù)高熱并伴胸膜炎、關(guān)節(jié)炎和骨髓炎等繼發(fā)癥，家畜感染本病則常出現(xiàn)流產(chǎn)、空懷、繁殖成活率降低，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅[6-7]。

Ⅳ分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，T4SS)是布魯氏菌重要的毒力因子，由virB操縱子編碼，基因序列高度保守，是橫跨細(xì)菌內(nèi)外膜的多蛋白復(fù)合物，對(duì)布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和存活必不可少的[8]。研究表明，Ⅳ分泌系統(tǒng)毒力作用主要依靠分泌的效應(yīng)蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，效應(yīng)蛋白常作用于關(guān)鍵的信號(hào)通路分子，以多種方式幫助布魯氏菌逃避宿主免疫監(jiān)視進(jìn)而在胞內(nèi)建立持續(xù)性感染。Myeni S等[9-10]通過(guò)TEM-1和CyaA報(bào)告系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)了效應(yīng)蛋白BtpA和BtpB，已有研究表明，BtpA和BtpB是T4SS毒力依賴性效應(yīng)蛋白。但BtpA和BtpB進(jìn)入宿主細(xì)胞后如何調(diào)控核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號(hào)通路仍存在爭(zhēng)議，以及與哪些宿主分子相互作用還有待挖掘。鑒于此，本研究以布魯氏菌T4SS virB效應(yīng)蛋白BtpA和BtpB基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)提取布魯氏菌16M總RNA、反轉(zhuǎn)錄、PCR、酶切等構(gòu)建真核表達(dá)載體，獲得了具有活性的BtpA和BtpB效應(yīng)蛋白，為進(jìn)一步研究布魯氏菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒 羊布魯氏菌16M標(biāo)準(zhǔn)毒株菌株由軍事獸醫(yī)研究所保存；293T細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物病原團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存；真核表達(dá)載體pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物科技公司；pMD18-T Vector、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自Takara公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA Marker和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京全式金生物公司產(chǎn)品；細(xì)菌總RNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ，NEB公司產(chǎn)品； PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、DNA瓊脂凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶，Takara公司產(chǎn)品；HiFiTaqMix，四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品；LipofectamineTM2000、恒溫恒濕培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、HA tag Rabbit Monoclonal Antibody，碧云天生物科技公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；搖床，美國(guó)Crystal公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已公布的布魯氏菌BtpA基因序列(Gene ID：29594531)和BtpB基因序列(Gene ID:29594062)，利用Oligo 7軟件分別針對(duì)BtpA和BtpB基因設(shè)計(jì)上、下游擴(kuò)增引物，并在合適位置加入了酶切位點(diǎn)和HA蛋白標(biāo)簽序列，送吉林省庫(kù)美生物有限公司合成。引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 BtpA和BtpB基因的引物序列

1.2.2 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增 于-80℃冰箱取出羊布魯氏菌16M菌種，取20 μL接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中,于37℃恒溫?fù)u床，190 r/min培養(yǎng)72 h。提取1.2 mL菌液12 000 r/min離心2 min，收集菌泥，并按照博日科技總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取布魯氏菌16M總RNA。對(duì)提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以上述得到的羊布魯氏菌16M cDNA為模板，利用表1中的引物，分別對(duì)BtpA和BtpB基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系均為50 μL：5×Primer STAR Buffer 10 μL，dNTP MIXture 4 μL，Primer STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Taq0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，滅菌水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序均為 ：98℃ 2 min ；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。對(duì)PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物回收純化。

1.2.3 重組質(zhì)粒pMD18T-BtpA和pMD18T-BtpB的構(gòu)建和鑒定 將回收純化的PCR產(chǎn)物BtpA和BtpB片段分別與pMD18-T Vector連接。連接體系為：BtpA片段/BtpB片段4 μL，pMD18-T Vector 1 μL，Solution 5 μL。連接后的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，均勻涂布于含Amp+(100 mg/L)LB平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行過(guò)夜篩選培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)。對(duì)增菌培養(yǎng)的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取后，利用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pMD18T-BtpA和pMD-18T-BtpB，并送長(zhǎng)春庫(kù)美生物有限公司，利用通用引物進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA的構(gòu)建和鑒定 利用EcoRⅠ和XbaⅠ分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T-BtpA、pMD18T-BtpB和真核表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行了雙酶切，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，獲得了大量純化的BtpA、BtpB和線性化的pcDNA3.1片段。在T4連接酶的作用下，將純化的BtpA和BtpB片段分別與線性化的真核表達(dá)載體pcDNA3.1，于16℃過(guò)夜連接。根據(jù)感受態(tài)細(xì)胞DH5α說(shuō)明書(shū)對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，經(jīng)含Amp+(100 mg/L)LB平板篩選后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行增菌純培養(yǎng)。對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA。

1.2.5 Western blot檢測(cè)BtpA和BtpB基因的表達(dá)

1.2.5.1 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將傳至第4代的293T細(xì)胞用2.5 g/L胰酶消化后，鋪于6孔板中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)到70%～85%左右。利用LipofectamineTM2000分別將重組陽(yáng)性質(zhì)粒pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，同時(shí)將空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，使用RAPA強(qiáng)裂解液得到總蛋白樣品，進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，置-20℃保存。

1.2.5.2 BtpA和BtpB表達(dá)檢測(cè) 取出蛋白樣，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液于水浴鍋中加熱10 min，以充分變性蛋白。以100 g/L SDS-PAGE電泳分離蛋白，先將電壓調(diào)為70 V，30 min之后改調(diào)為120 V，直至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。采用濕轉(zhuǎn)法，將蛋白轉(zhuǎn)印至甲醇激活的PVDF膜上，60 g/L脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，用TBST 10 min/次洗膜1次，加入抗HA一抗，于37℃搖床孵育2 h，用TBST 15 min/次洗膜3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，于37℃搖床孵育1 h，用TBST 15 min/次洗膜3次，最后用ECL化學(xué)法發(fā)光液進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BtpA和BtpB基因的擴(kuò)增

以羊布魯氏菌16M cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別獲得了BtpA(873 bp)和BtpB(924 bp)基因片段，其大小與預(yù)期相符，且條帶單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.BtpA基因片段；2.BtpB基因片段M.DNA Marker DL 2 000; 1.BtpA fragment; 2.BtpB fragment

2.2 重組質(zhì)粒pMD18T-BtpA和pMD18T-BtpB酶切鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T-BtpA和pMD18T-BtpB進(jìn)行雙酶切電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可得，BtpA和BtpB片段均成功連至pMD18-T質(zhì)粒。為進(jìn)一步驗(yàn)證，取酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送吉林庫(kù)美生物有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與已報(bào)道的BtpA和BtpB序列序列一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.未酶切pMD18T-BtpA；2.雙酶切pMD18T-BtpA；3.未酶切pMD18T-BtpB；4.雙酶切pMD18T-BtpB

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA酶切鑒定

利用EcoRⅠ和XbaⅠ分別對(duì)空質(zhì)粒pcDNA3.1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3和4。由圖3可知，空質(zhì)粒pcDNA3.1被雙酶切開(kāi)，呈線性化，條帶上移。由圖4可知，BtpA和BtpB片段均成功連至線性化質(zhì)粒pcDNA3.1，未酶切的質(zhì)粒呈2條帶。對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙向測(cè)序驗(yàn)證，顯示插入方向、堿基未突變和閱讀框正確，說(shuō)明真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA構(gòu)建成功正確。

2.4 Western blot檢測(cè)BtpA和BtpB的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組未出現(xiàn)條帶，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BtpA-HA組和pcDNA3.1-BtpB-HA組分別在32 ku和35 ku處出現(xiàn)了條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。說(shuō)明BtpA和BtpB基因在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 8 000；1.未酶切pcDNA3.1-BtpA-HA載體；2.雙酶切pcDNA3.1-BtpA-HA載體；3.未酶切pcDNA3.1-BtpB-HA載體；4.雙酶切pcDNA3.1-BtpB-HA載體

1.空質(zhì)粒pcDNA3.1；2.載體pcDNA3.1-BtpA-HA；3.載體pcDNA3.1-BtpB-HA

3 討論

布魯氏菌是一種隱形病原體，可依靠毒力因子Ⅳ分泌系統(tǒng)以多種途徑抑制宿主固有免疫進(jìn)而以“靜默”的方式侵染宿主細(xì)胞[11]。已有研究證明，Ⅳ分泌系統(tǒng)效應(yīng)子BtpA和BtpB是含Toll-IL-1受體結(jié)構(gòu)域蛋白，在感染早期可轉(zhuǎn)位于宿主胞內(nèi)，干擾宿主Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號(hào)，導(dǎo)致樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)成熟減少，進(jìn)而抑制促炎細(xì)胞因子的分泌和影響NF-κB信號(hào)通路的激活[12]。該過(guò)程對(duì)促進(jìn)布魯氏菌胞內(nèi)感染，建立慢性感染階段尤為重要。TLRs是一種跨膜蛋白，在結(jié)構(gòu)上分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，可以識(shí)別病原成分并啟動(dòng)先天免疫信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而TIR結(jié)構(gòu)域?yàn)門(mén)LRs的胞內(nèi)功能區(qū)，是TLRs活化后招摹接頭蛋白向下傳遞信號(hào)的區(qū)域。因此，效應(yīng)子BtpA和BtpB含有TIR區(qū)域，可競(jìng)爭(zhēng)性與TLRs下游的信號(hào)分子MyD88或TIRAP相互作用，進(jìn)而達(dá)到抑制宿主免疫反應(yīng)的目的[13]。如前所述，效應(yīng)子BtpA 和BtpB都可影響NF-κB的活化。但有些研究表明，BtpA 和BtpB在活化NF-κB信號(hào)通路時(shí)有著相反的作用，BtpA有抑制作用而B(niǎo)tpB可激活NF-κB活化[14-15]。而有些研究認(rèn)為， BtpA和BtpB均能抑制NF-κB信號(hào)通路的激活[16-17]。此外，F(xiàn)elix等發(fā)現(xiàn)BtpA和BtpB含有結(jié)構(gòu)WxxxE基序，該基序?qū)ΡＷo(hù)微管解聚很重要。WxxxE基序在BtpA和BtpB與微管的結(jié)合中起著結(jié)構(gòu)作用，和WxxxE gef家族蛋白一樣，其中，該基序定位了一個(gè)相鄰的催化環(huán)，對(duì)與特定的Rho GTPase相互作用很重要。這在一定程度上可以解釋布魯氏菌不引起細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，但與哪些宿主分子互作，以及如何發(fā)揮作用還不清楚[17]。綜上所述，雖然目前對(duì)于Ⅳ分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白BtpA和BtpB的研究很多，但仍有許多未解之謎需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，基因克隆表達(dá)技術(shù)為其提供了新的思路與手段。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)BtpA和BtpB蛋白的真核載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)，分別于32 ku和35 ku處出現(xiàn)了目的條帶，說(shuō)明293T細(xì)胞表達(dá)的蛋白有良好的反應(yīng)原性，為下一步解釋布魯氏菌效應(yīng)子BtpA和BtpB在活化NF-κB信號(hào)通路的“爭(zhēng)議”，以及釣取宿主互作蛋白提供了工具材料。

本研究選取了普遍使用的、可高水平穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的pcDNA3.1真核表達(dá)載體，該載體含SV40啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，雙重篩選標(biāo)記和復(fù)制區(qū)域，可融合表達(dá)多種外源基因，在基因表達(dá)中廣泛使用[18-19]。HA標(biāo)簽序列為YPYDVPDYA[20]，是目前廣泛應(yīng)用的表位標(biāo)簽之一，對(duì)外源蛋白空間結(jié)構(gòu)影響小，易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或C端，可利用通用的Anti-HA抗體檢測(cè)。293T細(xì)胞是常用來(lái)表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株[21-22]。因此，以pcDNA3.1為骨架，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，加入了EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)及HA標(biāo)簽，并將其成功轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,成功的表達(dá)了BtpA 和BtpB蛋白。為篩選效應(yīng)蛋白BtpA和BtpB在宿主細(xì)胞的互作蛋白，從宿主分子角度闡述布魯氏菌逃避免疫的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。