氟苯尼考對人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的防治效果研究

何杰珩，劉廣超，馬 驛，彭金菊，丁月霞

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）是一種非運動性的革蘭陰性桿菌， 無鞭毛， 不形成芽孢，瑞氏染色或美藍染色可見典型的兩極著色。該菌是兼性厭氧菌，對營養(yǎng)要求較嚴(yán)格，在血瓊脂平板上生長良好。該菌血清學(xué)種類眾多，大多數(shù)菌株有莢膜，起抗吞噬作用［1-3］。

病原為多殺性巴氏桿菌的巴氏桿菌病是一種具有高度傳染性的人畜共患呼吸系統(tǒng)疾病， 臨床特征是急性敗血癥和組織器官的出血性炎癥，主要通過消化道和呼吸道感染，可快速傳播，給人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來較大威脅［4-6］。

在治療巴氏桿菌病時， 使用抗生素是控制感染的有效方法。 隨著大量抗生素廣泛且不合理應(yīng)用，各種耐藥菌株源源不斷地出現(xiàn)，大大降低了抗生素的應(yīng)用效果，有資料表明，已有80.5%的多殺性巴氏桿菌對微生物抗性有限的抗生素表現(xiàn)出耐藥性［7］。 該研究旨在利用微量肉湯稀釋法篩選出體外抑菌效果好的藥物，觀察其防治效果，為其臨床推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（C48-3），由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

藥物：替米考星預(yù)混劑（20%），鹽酸多西環(huán)素可溶性粉 （10%）， 延胡索酸泰妙菌素預(yù)混劑（80%），鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素可溶性粉（大觀霉素10%與林可霉素5%）， 均由山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)； 硫酸新霉素可溶性粉（32.5%），酒石酸泰樂菌素磺胺二甲嘧啶可溶性粉（20%），氟苯尼考粉（10%），復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶鈉可溶性粉（10%），阿莫西林可溶性粉（10%），由佛山市南海東方澳龍制藥有限公司生產(chǎn)。

實驗動物：昆明種小白鼠90 只，體重18～22 g，雌、雄各半，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 多殺性巴氏桿菌菌液的制備 將多殺性巴氏桿菌菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h 后，將菌液接種于10 mL 肉湯培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h， 采用平板計數(shù)法計數(shù)，用營養(yǎng)肉湯稀釋至105CFU/mL。

1.2.2 MIC 的測定 采用微量肉湯稀釋法，于96孔板每排的各孔加入一定量上述稀釋好的菌液，再將稀釋好的抗菌藥物加入第1 孔， 依次倍比稀釋至第11 孔，第12 孔不加藥物作為菌液對照，使得1～11 孔中藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。每種藥物重復(fù)3 次。37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h 后觀察結(jié)果。

1.2.3 MBC 的測定 在MIC 試驗基礎(chǔ)上， 將上述MIC 檢測的澄清的各孔37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，從每孔吸取10 μL，分別涂布于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)（18～24 h）。 以瓊脂平板孔內(nèi)無細菌生長且藥物最小的濃度為該種藥物對該種菌株的MBC。 每種藥物重復(fù)3 次，如果有2 次結(jié)果相同則以相同結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2.4 人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的防治試驗 將多殺性巴氏桿菌接種于1%兔血清營養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)8～12 h， 采用平板計數(shù)法計數(shù)，用肉湯稀釋至所需濃度。 隨機選取45 只小白鼠進行治療試驗， 另外45 只小白鼠進行預(yù)防試驗。兩組試驗分別設(shè)陰性對照、陽性對照及氟苯尼考組。 將預(yù)試驗篩選能引起小白鼠在感染后24 h死亡率超過70%的多殺性巴氏桿菌菌液濃度作為攻毒濃度。預(yù)試驗確定陽性對照組每只小白鼠皮下注射濃度為103CFU/mL 的多殺性巴氏桿菌混懸液0.1 mL，陰性對照組每只小白鼠皮下注射生理鹽水0.1 mL。

1.2.4.1 治療試驗 攻毒當(dāng)天，陰性對照組15 只小白鼠， 皮下注射生理鹽水0.1 mL； 陽性對照組15 只小白鼠，皮下注射濃度為103CFU/mL 的多殺性巴氏桿菌混懸液0.1 mL；另外15 只小白鼠于頸背部皮下注射氟苯尼考藥液，按每千克體重20 mg原藥粉劑標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)給藥5 d，停藥后觀察10 d。

1.2.4.2 預(yù)防試驗 陰性對照組15 只小白鼠，皮下注射生理鹽水0.1 mL； 陽性對照組15 只小白鼠，皮下注射濃度為103CFU/mL 多殺性巴氏桿菌混懸液0.1 mL； 另外15 只小白鼠按每千克體重30 mg 原藥粉劑標(biāo)準(zhǔn)， 連續(xù)灌服氟苯尼考藥液5 d后， 皮下注射與陽性對照組相同濃度和劑量的多殺性巴氏桿菌混懸液， 自攻毒之日開始連續(xù)觀察10 d。 統(tǒng)計各組死亡小白鼠數(shù)量，計算氟苯尼考對感染小白鼠的保護率。

防治效果用保護率進行評價： 保護率 （%）=（陽性感染對照組的死亡數(shù)-藥物試驗組死亡數(shù)）/陽性感染對照組的死亡數(shù)×100%。

按常規(guī)檢驗方法解剖死亡小鼠進行觀察，分離體液及組織中的細菌鏡檢； 并將病料無菌接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個菌落，進行純培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，涂片鏡檢，確定死亡原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌藥物對多殺性巴氏桿菌的體外抑制效果

抗菌藥物對多殺性巴氏桿菌的體外抑制效果見表1，9 種抗菌藥物中， 氟苯尼考和多西環(huán)素的抑菌效果和殺菌效果相同且最強，MIC 均為1 μg/mL，MBC 均為2 μg/mL；延胡索酸泰妙菌素的MIC為64 μg/mL，MBC 為128 μg/mL，抑菌效果和殺菌效果最差。

表1 不同抗菌藥物對多殺性巴氏桿菌的體外抑制效果 單位：μg/mL

2.2 人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的防治效果

2.2.1 藥物治療試驗結(jié)果 選擇氟苯尼考作為研究對象， 開展人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的防治效果試驗，結(jié)果見表2。 陰性對照組小白鼠未攻毒和治療，死亡率為0；攻毒后的陽性對照組小白鼠死亡13 只，死亡率為86.7%，大多數(shù)小白鼠死亡時間集中在攻毒后12 h 內(nèi)；注射氟苯尼考藥物組的小白鼠死亡2 只， 死亡時間分別為攻毒后28 h 和72 h， 與陽性對照組比較， 死亡率明顯下降，僅為13.3%，氟苯尼考對小白鼠感染多殺性巴氏桿菌的保護率為84.6%。

表2 氟苯尼考對人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的治療效果

2.2.2 藥物預(yù)防試驗結(jié)果 未感染多殺性巴氏桿菌的小白鼠沒有出現(xiàn)死亡， 攻毒后陽性對照組小白鼠死亡14 只，死亡率為93.3%，大多數(shù)小白鼠死亡時間集中在攻毒后12 h 內(nèi)；灌服氟苯尼考藥物組的小白鼠在攻毒后21～22 h 內(nèi)陸續(xù)死亡3只，死亡率與陽性對照組比較，下降20%，灌服藥物組的存活率高于陽性對照組， 氟苯尼考對小白鼠感染多殺性巴氏桿菌的保護率為78.6%， 預(yù)防試驗結(jié)果見表3。

表3 氟苯尼考對人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的預(yù)防效果

2.3 死亡小白鼠解剖特征

解剖15 只死亡小白鼠， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)四肢末端、耳、鼻、口唇發(fā)紺或蒼白，耳部偶見充血、瘀血；趾（指）部末端出血，牙齦有散在出血點；皮下廣泛性出血，有出血斑，有大量淡黃色或黃色膠凍樣浸出物；胸骨、心外膜有出血點和出血斑；肺出血、瘀血，代償性氣腫，呈現(xiàn)“花斑肺”或“橡皮肺”樣外觀；胸腔、心包纖維素性炎，胸膜與肺、心包粘連，胸腔積液； 腹腔有大量黃白色腹水， 有干酪樣物質(zhì)，內(nèi)臟器官廣泛性粘連，脂肪出血；肝臟充血、瘀血，有灰白色壞死斑，部分膽囊高度充盈；脾臟瘀血、腫大，內(nèi)部有散在大小均一的白色結(jié)節(jié)；胃內(nèi)容物有大量黃色或淡黃色氣泡； 腸黏膜充血、瘀血，腸腔內(nèi)含有淡紅色或黃綠色液體；腎臟表面有灰白色壞死灶；子宮和卵巢充血、出血、瘀血。

2.4 細菌分離、鑒定結(jié)果

及時將剖檢死亡小白鼠肺、肝、脾等病料進行細菌的分離培養(yǎng)，在普通培養(yǎng)基上生長貧瘠，在麥康凱培養(yǎng)基上不生長，在鮮血培養(yǎng)基上生長良好，呈淡灰白色、閃光的露珠狀小菌落，且無溶血現(xiàn)象（見圖1）。 選用新鮮的病變組織涂片，經(jīng)瑞氏和美藍染色后，光學(xué)顯微鏡下檢查；涂片染色分離培養(yǎng)的細菌，光學(xué)顯微鏡下檢查。 分離菌呈現(xiàn)球桿狀或短桿狀，兩端鈍圓，以單個和成雙排列為主，革蘭染色陰性（見圖2），涂片用美藍染色時可見典型的兩極著色。

圖1 血平板上多殺性巴氏桿菌形態(tài)

圖2 油鏡下多殺性巴氏桿菌形態(tài)

3 討論

3.1 不同抗菌藥物對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果

據(jù)報道，多殺性巴氏桿菌分離菌對氟苯尼考、阿莫西林—克拉維酸、 恩諾沙星和磺胺甲氧嘧啶敏感，而對四環(huán)素、紅霉素和慶大霉素的敏感性較低［8］；而氨基糖苷類、萬古霉素、紅霉素和克林霉素與青霉素相比，抗菌效果較差；頭孢菌素和氟喹諾酮則是最有效的藥物。但在耐藥性方面，磺胺類藥物的耐藥率最高，其次是青霉素和紅霉素［9］。

該試驗中， 硫酸新霉素和鹽酸大觀霉素屬于氨基糖苷類抗菌藥， 對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果較差，與上述文獻資料相同；泰樂菌素和替米考星屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥， 替米考星對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果稍強于泰樂菌素， 與其他文獻資料結(jié)果相似， 但是近年來發(fā)現(xiàn)替米考星的耐藥菌株越來越多；氟苯尼考屬于酰胺醇類抗生素，對多殺性巴氏桿菌有較好的抗菌活性， 且對耐氯霉素、甲砜霉素的細菌敏感。 有研究表明，氟苯尼考對雞多殺性巴氏桿菌的MIC 為0.5 μg/mL，可能與試驗所用菌株不同有關(guān)。 多西環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素，具有廣譜抑菌作用；泰妙菌素屬于截短側(cè)耳類抗菌藥，對豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)較好的殺菌效果， 對多殺性巴氏桿菌的抑菌效果較差。 該試驗中所用的磺胺藥物是酒石酸泰樂菌素磺胺二甲氧嘧啶， 屬于兩種抗菌藥物聯(lián)合使用，其抑菌效果好是否與泰樂菌素聯(lián)用有關(guān)還有待驗證。

3.2 氟苯尼考對人工感染多殺性巴氏桿菌小白鼠的防治效果

氟苯尼考是動物專用的廣譜、抑菌抗生素，對許多革蘭陽性和陰性的細菌有效， 對呼吸道感染和腸道感染也有較好的療效。同時，與同屬四環(huán)素類抗生素的氯霉素相比，氟苯尼考更加具有優(yōu)勢，用藥后不會產(chǎn)生再生障礙性貧血的不良反應(yīng)［10］。

該試驗中， 選用氟苯尼考預(yù)防和治療小白鼠的多殺性巴氏桿菌感染， 其預(yù)防試驗和治療試驗的保護率分別為78.6%、84.6%， 對小白鼠感染多殺性巴氏桿菌具有較好的療效。 而所謂 “防重于治”，一般情況下藥物對動物的預(yù)防效果優(yōu)于治療效果，但是與其他文獻的研究結(jié)果不同的是，該試驗數(shù)據(jù)表明氟苯尼考預(yù)防試驗的保護率低于治療試驗；可能是因為預(yù)防試驗小組中選擇“灌服”的投藥方式， 在一定程度上對小白鼠造成損傷以及較大的應(yīng)激，從而導(dǎo)致其死亡率上升。 另外，相比陽性對照組小白鼠， 預(yù)防試驗組中小白鼠的臨床癥狀比較輕，消瘦程度有所改善，第一只小白鼠死亡時間延遲9 h；治療試驗組中小白鼠無明顯臨床癥狀，多是急性死亡，死亡時小白鼠無明顯消瘦，第一只小白鼠死亡時間延遲16 h。

解剖發(fā)現(xiàn)， 死亡小白鼠普遍存在全身多發(fā)性出血，心包、胸腔和腹腔纖維素性變化，可見黃色干酪樣物質(zhì)；病程較長、尸體消瘦的小白鼠肺部病變較明顯，肺間質(zhì)增生。巴氏桿菌病的臨床特征是急性敗血癥和組織器官的出血性炎癥， 引起動物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎［5］，這與該試驗的肺部病變結(jié)果相似。

有研究表明，90%以上的牛和豬感染多殺性巴氏桿菌，對氟苯尼考敏感［11］；而經(jīng)氟苯尼考治療的山羊與未接受任何抗生素治療的對照組山羊相比，有顯著的臨床改善，氟苯尼考對由多殺性巴氏桿菌引起的山羊感染是最有效的抗生素之一［12］；氟苯尼考低、中、高劑量均對雞多殺性巴氏桿菌病有較好的療效。 因此，在病例治療中，為盡量避免多種藥物聯(lián)合使用帶來的副作用和不良反應(yīng)，以及細菌耐藥性的產(chǎn)生， 建議盡早使用抑菌效果較好的抗生素，并制定合理的療程，保持一定的血藥濃度，盡快控制病情。