生物鐘生理功能及影響因素的研究進展

張春華，張崇志，金 鹿，桑 丹，李勝利，王澤平，劉要仙，烏龍都特，孟根曹，孫海洲

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.伊金霍洛旗農(nóng)牧技術推廣中心，內(nèi)蒙古 伊金霍洛旗017200；3.伊金霍洛旗農(nóng)牧業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，內(nèi)蒙古 伊金霍洛旗 017200；4.烏審旗家畜改良工作站，內(nèi)蒙古 烏審旗 017300）

最初， 人們猜想生物鐘可能是動物機體對白天和黑夜變化的反應，即白天行動，晚上休息。 后來，試驗證明，生命體在沒有任何環(huán)境變化的條件下仍然表現(xiàn)出以24 h 為周期的節(jié)律行為。 生物鐘系統(tǒng)使生命體自身的節(jié)律與外界環(huán)境的節(jié)律同步化，不僅能夠優(yōu)化生物體的日常行為節(jié)律，還參與了生命體大多數(shù)的生理過程。自18 世紀科學家們報道生命體存在近似24 h 的晝夜節(jié)律以來，在果蠅［1］、斑馬魚［2］、小鼠［3］、肉雞［4］、山羊［5-6］、綿羊［7］、馬［8］、奶 牛［9］和 人［10］等 方 面 開 展 一 系 列 的 研 究 工作， 以揭示生物節(jié)律在生命體生理過程中的內(nèi)在機制。 進入21 世紀以來，生物節(jié)律的研究已達到一個新的高度，標志性成果是2017 年美國科學家因發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律生物鐘的分子機制而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

1 生物鐘的構成及作用機制

1.1 晝夜節(jié)律的構成

生物體的生理反應都遵循著以24 h 為周期的節(jié)律行為，這個周期長度一般對溫度不敏感，受到環(huán)境自然光的明暗信號的約束， 形成了一種以近似24 h 為周期的振蕩器（oscillator），學者們將這種“晝夜節(jié)律”稱為生物鐘（circadian clock）。 生物鐘是機體為了適應環(huán)境， 在進化過程中自然選擇的作用下獲得， 而且在根據(jù)環(huán)境變化調節(jié)生理功能和行為中起著重要的作用［11］。 生物鐘的組成包括輸入途徑 （接受并傳遞外界的刺激至振蕩器）、振蕩器（啟動并產(chǎn)生節(jié)律性的振蕩器）、輸出途徑（節(jié)律的輸出部分）三部分。 振蕩器是維持生物節(jié)律的關鍵部分， 生物體內(nèi)關鍵基因的表達隨晝夜節(jié)律呈現(xiàn)規(guī)律性的振蕩， 導致相關蛋白水平也隨晝夜更替有規(guī)律地振蕩， 通過對下游鐘控基因（clock controled gene,CCG）表達的調控，調節(jié)眾多生理過程。

1.2 生物鐘的作用機制

在細胞水平上，這些節(jié)律是由能產(chǎn)生振蕩基因表達的反饋回路控制，并且與染色質體系結構的晝夜變化、信使RNA 的處理、蛋白活性和蛋白質周轉相關［12］。 研究已表明，哺乳類動物表達的生 物 鐘 基 因 主 要 有Clock、Period （Per1、Per2、Per3）、Bmal1、Cryptochrome（Cry1、Cry2）等［13］，這些節(jié)律性基因構成了生物體內(nèi)相對保守的晝夜振蕩的自身調控反饋回路。 節(jié)律基因由晝夜振蕩正負反饋回路組成：①轉錄—翻譯反饋回路的正性成分， 開啟節(jié)律基因并使之表達。 Clock 和Bmal1 是重要的生物鐘基因，Bmal1 基因高表達通過轉錄因子bHLH-PAS 能夠激活Clock， 促進核心轉錄因子BMALI 與CLOCK 形成BMALICLOCK 異二聚體。 作為正性成分調節(jié)因子，BMALI-CLOCK 異二聚體能夠結合其他節(jié)律基因及節(jié)律控制基因的啟動子區(qū)相關元件， 以激活Period （Per1、Per2、Per3）、Cryptochrome （Cry1、Cry2）和Rev-Erbα 等基因的轉錄［14］。 ②轉錄翻譯后負性成分阻止正性成分表達。Per 基因經(jīng)轉錄、翻譯的PER 蛋白積累在胞漿中并逐步被CKIε磷酸化而降解。 隨著時間的推移，CRY 蛋白在胞漿中積累并形成穩(wěn)定的CKIε/PER/CRY 聚合物。進入細胞核CKIε/PER/CRY 的CRY1 能夠擾亂BMALI-CLOCK 聚 合 物 轉 錄 復 合 物［15］，從 而 抑制其他節(jié)律基因及節(jié)律控制基因的轉錄，并呈現(xiàn)出Clock 和Bmal1 核心生物鐘的負反饋環(huán)路調節(jié)［16］。 然而，Dbp、E4bp4 等節(jié)律控制基因在動物體生物鐘回路、激素合成以及神經(jīng)信號傳遞等方面發(fā)揮著重要的作用。 ③Rev-Erbα 蛋白進入核內(nèi)后抑制正調節(jié)端Bmall 基因的轉錄且表達水平下調，而負調節(jié)端Cry 基因阻止Rev-Erbα 基因轉錄，因此Rev-Erbα 基因成為連接正負調節(jié)的中調因子， 形成了節(jié)律性基因晝夜振蕩的嵌套回 路［14］。

2 生物鐘的生理功能

哺乳動物的生物鐘基因最早發(fā)現(xiàn)于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nueleus，SCN），基本的運作模式是：生物鐘基因的轉錄和翻譯、生物鐘蛋白的生成、構成自動調節(jié)的反饋回路。 隨著后來研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)生物鐘基因不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，在皮膚毛囊［6］、肝臟［17］、腎臟［18］、心臟［19］、肌肉［20］、脂肪［21］、生殖器官［22］等組 織中也 有表達。SCN 必須周期性地調整外周生物鐘,以防止肝臟、心臟、腎臟等外周組織中生物鐘基因表達量的減少, 但是SCN 對外周組織中生物鐘的調控機制目前還不清楚［23］。更多的研究結果表明，生物鐘基因在調節(jié)毛發(fā)生長系統(tǒng)、 內(nèi)分泌系統(tǒng)、 免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要的作用。

2.1 毛發(fā)生長系統(tǒng)

動物毛發(fā)生長的晝夜節(jié)律在研究中普遍被發(fā)現(xiàn)，動物毛發(fā)循環(huán)生長受到生物鐘基因的調控［15］。在Clock 和Bmal1 基因敲除的小鼠研究中， 發(fā)現(xiàn)毛囊的生長期被顯著推遲， 生物鐘基因Clock 和Bmal1 能夠調節(jié)毛囊細胞周期的活動［15，24］。 Clock和Bmal1 基因敲除的小鼠， 毛囊發(fā)育被阻止在生長早期，Clock 基因在次級毛囊的休止期和生長早期高度表達， 生物鐘基因控制著毛囊的整個發(fā)育過程［25］。 生物鐘基因在皮膚毛囊中的表達呈現(xiàn)出晝夜的變化，Cry1 和Cry2 基因敲除后， 小鼠的生物鐘缺失， 同時Per 基因在調控皮膚毛囊的發(fā)育中也發(fā)揮重要的作用。 Tanioka 等［26］發(fā)現(xiàn)皮膚中有類似其他外周器官的固有的晝夜節(jié)律的振蕩周期，生物鐘基因在皮膚毛囊中有表達，而且發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚毛囊發(fā)育周期性變化過程受生物鐘基因的調控。生物鐘基因（Bmal1、Clock、Cry1）伴隨遼寧絨山羊次級毛囊周期循環(huán)過程出現(xiàn)周期性的表達變化［5］。 動物皮膚中的所有細胞類型存在生物鐘基因的表達， 而且生物鐘主要的基因表達在次級毛囊的休止期和生長早期。 動物毛發(fā)的生長周期依賴生物鐘基因的表達，在休止期至生長期階段，生物鐘基因量呈現(xiàn)高表達［15］。

2.2 內(nèi)分泌系統(tǒng)

生物鐘在調節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)中起著重要的作用，同樣，內(nèi)分泌系統(tǒng)同步調節(jié)著生物鐘。

2.2.1 糖皮質激素 糖皮質激素（glucocorticoids,GC）屬于類固醇激素，在炎癥、代謝、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著多種生理功能， 對維持機體的正常生長發(fā)育及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等大多數(shù)的生理過程具有重要的調節(jié)作用。GC 的廣泛生物學效應主要由糖皮質激素受體 （glucocorticoid receptor，GR）介導，它在大多數(shù)外周組織中有表達，而在SCN 中沒有表達。研究表明，糖皮質激素及其受體信號不僅能夠引起機體內(nèi)生物鐘基因的表達量發(fā)生顯著變化， 還可以引起外周生物鐘基因表達時相的移動［27］。 小鼠Per1 基因被敲除后，糖皮質激素表達量增加［28］，Cry1 和Cry2 的表達能夠抑制GR 的含量［29］，Cry1 和Cry2 表現(xiàn)出了與“時鐘無關”的相互作用，主要是指不涉及BMAL1-CLOCK的相互作用。 研究發(fā)現(xiàn)，Cry1 和Cry2 可能與激素反應元件相結合，同時也是GR 的結合位點［30］。 最近的研究表明，CLOCK 與GR 能夠直接發(fā)生相互作用，并對GR 進行乙酰化，從而通過降低其結合DNA 的能力， 抑制其活性；CRY 也能夠通過直接結合GR 而抑制GR 的功能［29］。也有許多研究報道了關于GC 與節(jié)律基因的相互作用［31］，Per2 基因在小鼠腦部的表達依賴GC 的節(jié)律變化［32］，而且小鼠腎上腺生物鐘功能的缺失修改了肝臟中Per1基因的表達［33］，其生物鐘基因表達改變的進一步機制未被揭示。

2.2.2 褪黑激素（MEL） MEL 由松果體分泌，含量能夠隨光周期的變化而改變。 哺乳動物的晝夜節(jié)律也是以MEL 夜間分泌持續(xù)時間長短變化為中心，MEL 主要通過褪黑激素受體1A （MT1）和2A（MT2）的介導而發(fā)揮功能［34］。 MT1 在垂體腺結節(jié)部（pars tuberalis，PT）有豐富的表達，所以MEL能直接作用于PT 介導光周期信號。哺乳動物垂體PT 部生物鐘基因的表達受到MEL 的調控而呈現(xiàn)節(jié)律變化，Cry1 和Per1 可能解碼了MEL 分泌的節(jié)律信號，PT 細胞作為光周期信號記憶體而扮演分子日歷的角色［35］。 在哺乳動物中，2 型脫碘酶（DIO2）和3 型脫碘酶（DIO3）不僅受到MEL 信號的作用影響，而且依賴光周期調控，同時DIO2 和DIO3 也介導了光周期信號對下丘腦局部甲狀腺激素（TH）濃度的控制。 動物在長光照時，下丘腦三碘甲狀腺原氨酸（T3）濃度的增加依賴DIO2 的增加； 短光照時，DIO2 濃度的下降伴隨T3 濃度的降低［36］。 然而，DIO2/DIO3 對TH 的調節(jié)機制可能也存在種屬的差異， 光周期使動物體基礎代謝的改變可能是TH 改變的根本因素。 因此，下丘腦—垂體—MET 系統(tǒng)與生物鐘基因既互為依存又相互聯(lián)系。

MEL 信號能夠通過與生物鐘核心振蕩器的平衡調節(jié)維持生命的健康， 機體內(nèi)源生物鐘的功能失調、MEL 受體基因的多態(tài)性、年齡以及與疾病相關的MEL 含量的下降很可能是誘發(fā)代謝綜合征、2 型糖尿病、高血壓等疾病的因素。 MEL 對哺乳動物SCN 有很大的影響， 主要表現(xiàn)在人類的生物鐘功能方面，涉及MT2 信號的表達。 研究表明，MEL在脂肪組織同步的晝夜節(jié)律中的作用已被證明，在離體大鼠脂肪細胞，MEL 能夠上調Per1、Cry1 和Bmal1 的mRNA 表達水平， 而且Per2 和Bmal1 的時相關系能夠被MEL 調節(jié)［37］。 以小鼠為研究模型結果表明，MEL 受體的敲除能夠抑制Per 基因的表達，Per 基因的表達被活化的MEL 受體調節(jié)，Per1/2 的晝夜節(jié)律被擾亂后會干擾MEL 在夜間的分泌［38］。 Gupta 等［39］研 究 了 在 夏 季 和 冬 季 熱 帶 松 鼠SCN 中MT1、Per1 和Cry1 基因的表達隨著血漿中MEL 濃度的24 h 的變化規(guī)律，提出MEL 的季節(jié)性變化不僅調節(jié)了MT1 在SCN 中的表達，而且修改了MT1 的功能， 也通過改變Per/Cry 的表達揭示SCN 分子時鐘基因表達譜。

2.3 免疫系統(tǒng)

近年來， 生物鐘基因在免疫系統(tǒng)方面的研究成為熱點。 核心生物鐘基因在小鼠脾臟的巨噬細胞、樹突狀細胞、B 細胞以及人的淋巴細胞中呈現(xiàn)出振蕩性表達。 小鼠的晝夜周期被打亂后會增加它們對炎性疾病易感的概率， 從而證實生物鐘影響動物免疫系統(tǒng)。研究表明，機體的生物鐘能夠通過某一信號通路控制白介素-17 （IL-17） 生成CD4+輔助T 細胞 （TH17）［40］。 Toll 樣受體家族的TLR9 （toll-like receptor 9） 是 巨 噬 細 胞 識 別CpGDNA 的模式識別受體，呈現(xiàn)節(jié)律性表達，同時錯配在Per2 基因突變小鼠的免疫組織中（在整個脾臟中表達上調， 但在脾臟的巨噬細胞中表達下調）。 在調控腹腔巨噬細胞方面，生物鐘的siRNA能夠降低TLR9 表達。在TLR9 高表達小鼠表現(xiàn)為更好的先天免疫反應。 在膿毒癥小鼠模型中，TLR9 表達的高峰期增加敗血癥的嚴重程度［41］。研究表明，Clock 基因敲除的小鼠限制了T 細胞抗原反應； 而且小鼠在白天比在夜晚表現(xiàn)出更強的T 細胞免疫反應應答；生物鐘E4 啟動結合蛋白能夠負向調節(jié)Dbp 控制基因和正向調節(jié)自然殺傷細胞的發(fā)育，B 細胞能夠轉換到免疫球蛋白IgE 和T細胞反應［42］；小鼠有自身的生物節(jié)律，這種生物節(jié)律被擾亂后，會降低自然殺傷細胞的活性［43］。總之，上述研究提供了一些生物鐘基因與免疫應答相互關系。

2.4 生殖系統(tǒng)

生殖生物鐘也稱生殖生理鐘， 學者們在外周生物鐘系統(tǒng)的研究中表明，生物鐘基因在小鼠、大鼠和牛的卵巢中呈振蕩性表達［44］。 研究表明，Bmal1 基因敲除雌性小鼠生育能力下降， 而且延緩了發(fā)情期［45］。 Bradshaw 等［46］認為生物鐘基因在卵巢中的表達對其發(fā)育有重要的意義。 生物鐘基因Bmal1、Cry、Per2 在牛卵巢中有表達，且未受到卵泡刺激素的影響， 但Clock 基因與卵泡發(fā)育息息相關。 最近的研究發(fā)現(xiàn)， 生物鐘基因Bmal1、Clock、Cry1/2、Per1/2 在小鼠妊娠后期子宮、胎盤和胎膜等組織中均有表達， 表明生物鐘基因與妊娠分娩有關，但其生理意義有待觀察［45］。

研究表明， 生物鐘基因在精子細胞中呈依賴性表達［22］。 CLOCK 和BMAL1 蛋白被定位于染色體中，而且在雄性生殖細胞中發(fā)現(xiàn)了胞漿細胞器，但其中的生理意義還不確定， 然而精子細胞的Bmal1 基因敲除后表現(xiàn)為畸形。 也有研究表明，小鼠被敲除Bmal1 基因純合子后， 精子活力和受精能力未受到影響，但精子數(shù)量顯著減少［47］。 Per 基因對昆蟲精子釋放起著重要的調控作用［48］。 生物鐘基因在雌性和雄性生殖系統(tǒng)中被推測為非24 h的獨立性生物鐘，這也以另一種方式理解超過24 h 的生物鐘。 然而，24 h 的周期性循環(huán)也獨立于生殖系統(tǒng)中。

3 外界條件對生物鐘的影響

3.1 光周期對生物鐘的影響

光照條件的變化調節(jié)生物節(jié)律可能的生理途徑是： 當光信號直接作用于眼中的光敏感視黃醛神經(jīng)細胞時， 通過視網(wǎng)膜下丘腦纖維使光信號到達動物體母鐘SCN，并作用于松果體，由松果體分泌大量的MEL 以調節(jié)動物機體的其他內(nèi)分泌激素，進而促進心臟、肝臟、腎臟及內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等外周組織的子鐘的生物鐘基因的轉錄調節(jié)晝夜節(jié)律［49-50］（見圖1）。

圖1 生物鐘調節(jié)機體生理代謝的綜合作用［50］

研究表明， 光照條件的變化能夠顯著影響皮膚中Per1、Per2 基因的表達水平［26］（見圖2）。 小鼠圍產(chǎn)期晝夜節(jié)律基因在機體大多數(shù)組織中表達，而且隨著光周期的改變， 生物鐘基因能夠通過協(xié)調內(nèi)分泌系統(tǒng)和生理代謝的變化促進泌乳［51］。 以馬為研究對象也表明了光周期能夠改變毛囊節(jié)律基因Cry1、Per1、Per2 等的表達［8］。 以Soay 綿羊肝臟為研究對象， 結果表明光周期也顯著影響了肝臟中晝夜節(jié)律基因的表達［7］。 光周期能夠通過調節(jié)生物節(jié)律改變奶牛內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝能力，進而影響奶牛的泌乳性能［51］，其機制可能是通過下丘腦—垂體—內(nèi)分泌—生物鐘途徑實現(xiàn)的。 短光照能夠促進干奶期奶牛乳腺的生長， 使泌乳期產(chǎn)奶量能夠增加3～4 kg/d，而催乳素（PRL）和類胰島素生長因子-1（IGF-1）含量降低［9］。

盡管每個組織都從中央時鐘接收信息以協(xié)調其功能， 但每個組織也有能力獨立地對光的變化做出反應，并感受白天和夜晚光強度的變化。研究者們比較了小鼠模型中的健康小鼠和中央時鐘受損小鼠表皮和肝臟的晝夜節(jié)律， 確認這兩個組織對隨時間推移而發(fā)生變化的光照有自主性［52-53］。

3.2 營養(yǎng)水平對生物鐘的影響

研究表明，動物肝臟器官的營養(yǎng)代謝途徑大部分是由生物鐘節(jié)律基因控制［54-55］，Bmal1 通過節(jié)律性調節(jié)肝臟線粒體動力學促進機體代謝健康［56］。食物信號對生物鐘（尤其是外周生物鐘）的信號調控作用已被大量的實驗證實， 不同的飲食習慣和食物的熱量差異會影響體內(nèi)生物鐘的信號［57-58］。晝夜節(jié)律控制腸胃消化［59］，營養(yǎng)水平、攝食的時間和周期對機體晝夜節(jié)律的調節(jié)和代謝有顯著影響，動物消化器官在夜間的機能下降，基礎代謝很低，飲食誘發(fā)的產(chǎn)熱在早上最高，在晚上最低。 能量水平對肝臟代謝及營養(yǎng)分配重新編程有多方面的影響，通過擾亂生物鐘基因BMAL1-CLOCK 和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）影響正常的晝夜節(jié)律。 研究表明， 小鼠中高脂日糧使PPAR-γ 因子在肝臟中呈現(xiàn)振蕩性的表達［17］，在肝臟、肌肉等組織和器官中，許多與代謝相關的基因表達都呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律性。 這些基因參與脂代謝、膽固醇合成、糖代謝及轉運、氧化磷酸化等生理過程的調控。 在動物的生物鐘調控通路中，細胞核內(nèi)激素受體REV-ERB 和ROR 構成了一個反饋回路，調節(jié)正調控元件Bmal1 的表達。參與代謝調節(jié)的許多重要基因， 其表達也都直接受到生物鐘的調節(jié)， 如營養(yǎng)傳感器基因SIRT1、AMPK，代謝酶基因Alas1、Hmger，代謝關鍵中間物NAD+，核受體PPAR-γ 等。

4 小結

盡管隨著一系列生物鐘基因及蛋白的發(fā)現(xiàn)和生物鐘各個因子運作機制的揭示， 人們對晝夜節(jié)律生物鐘認識取得了很大進步， 但還存在很多需要探索和研究的未知領域。例如：①生物鐘基因之間的協(xié)同和拮抗關系如何。 ②生物鐘基因與其他調節(jié)因子是如何相互作用調節(jié)生命活動的。 ③輸入信號作用于振蕩器及輸出信號的分子機制。 ④外周各個組織器官的振蕩器是通過哪些方式互相協(xié)調的。 ⑤下丘腦視交叉上核對外周組織生物鐘是否也有調控的作用，以及如何調控。⑥光周期和營養(yǎng)水平的變化如何影響生物鐘以改變動物的生產(chǎn)性能等。生物鐘基因生理機制的進一步研究，對揭示生命規(guī)律的本質、生物進化的分子基礎、生命遺傳學等的研究領域具有重要意義， 同時也為人類醫(yī)學及農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)提供了新的研究思路和理論依據(jù)。