UPLC-MS/MS法測定黃酒中8 種生物胺

王可利，葉 泰，徐 斐，曹 慧，袁 敏，于勁松，陰鳳琴，吳秀秀

（上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心，上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093）

生物胺是具有生物活性的低分子含氮有機(jī)化合物的總稱，主要由氨基酸脫羧基后產(chǎn)生，也可通過微生物對醛酮的氨基轉(zhuǎn)移作用產(chǎn)生[1]。生物胺廣泛存在于各種食品中，如水產(chǎn)品、酒類產(chǎn)品、肉制品、乳制品等[2]，一般發(fā)酵食品中的生物胺含量明顯高于非發(fā)酵食品[3]。作為氮源，適量的生物胺在人體的神經(jīng)系統(tǒng)與心血管系統(tǒng)中能夠參與DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成、穩(wěn)定生物膜以及調(diào)節(jié)胃酸分泌等重要生理作用[4]。但過量的生物胺會影響人體健康，引起一系列不良癥狀，如頭痛、嘔吐、腹瀉、血壓變化等，嚴(yán)重可致呼吸困難、休克甚至死亡，有些生物胺可與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成致癌的亞硝胺[5-6]。此外，生物胺也常作為評價(jià)貯存過程中，食品的新鮮度或腐敗變質(zhì)程度的重要指標(biāo)[3]。

現(xiàn)有檢測食品中生物胺的方法主要有液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-11]、薄層色譜法[12-13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]等儀器方法，其中最常用的是反相高效液相色譜法，樣品經(jīng)衍生化處理后連接紫外、熒光或二極管陣列檢測器進(jìn)行分析。Henríquez-Aedo等[16]采用高效液相色譜-熒光法在45 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了智利葡萄酒中6 種生物胺的定量分析；曹利瑞等[17]建立了高效液相色譜-紫外法用于黃酒中9 種生物胺的檢測，結(jié)果表明9 種生物胺可在40 min內(nèi)分離。但是，這2 種方法均存在分析時間較長的缺點(diǎn)。為了更加快速地檢測食品中生物胺，Sagratini等[18]建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，可在25 min內(nèi)檢測魚中的8 種生物胺，其檢出限范圍為0.02～0.25 mg/kg；Yoon等[19]建立的高效液相色譜-紫外法，可在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵農(nóng)產(chǎn)品中8 種生物胺的快速定量分析，這種方法的檢出限范圍為0.01～0.1 mg/kg。雖然這2 種方法的分析時間較短，但仍然無法滿足食品中痕量生物胺的快速分析、檢測的需求。

黃酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵型酒精類飲料，含有豐富的氨基酸與維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，黃酒在發(fā)酵過程中，一些微生物（乳酸菌、酵母菌等）產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，使游離的氨基酸脫羧形成相應(yīng)的生物胺[20]。人體攝入黃酒后，生物胺經(jīng)胃腸道黏膜上的單胺氧化酶、二胺氧化酶及多胺氧化酶等分解[21-22]，然而乙醇會抑制這些酶的活性[23-24]。李彬彬[25]和張來穎[26]等發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)低于10%的乙醇溶液可增加脫羧酶的活性[25-26]，而12%乙醇溶液會抑制91%的胺氧化酶活性[27-28]。我國黃酒中酒精含量一般在8.5%～17.0%之間。因此，黃酒中的生物胺會給人體帶來更大的健康風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過丹磺酰氯衍生化反應(yīng)，優(yōu)化萃取試劑的種類及檢測條件，建立基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測8 種生物胺的方法，并考察其在黃酒樣品中生物胺檢測的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒樣品 市購。

β-苯乙胺鹽酸鹽（純度≥99%）、色胺鹽酸鹽（純度≥98%） 上海麥克林生化科技有限公司；腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽（純度均不小于98%）、亞精胺三鹽酸鹽、精胺四鹽酸鹽（純度均不小于99.5%）、組胺二鹽酸鹽、丹磺酰氯（純度均不小于99%）、1,7-二氨基庚烷（純度98%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易公司；甲酸（質(zhì)譜純） 美國賽默飛世爾科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；乙酸乙酯（色譜純）、氨水、碳酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290-6490超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源） 美國安捷倫科技公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；0.22 μm一次性針頭濾器 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm） 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液，B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；梯度洗脫：0～2 min，50% A、50% B；2～10 min，50%～25% A、50%～75% B；10～13 min，25%～0% A、75%～100% B；13～16 min，0% A、100% B；16～16.1 min，0%～50% A、100%～50% B；16.1～19 min，50% A、50% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1.0 mL 250 ng/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于15 mL離心管，依次加入250 μL內(nèi)標(biāo)溶液、1.0 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL氫氧化鈉溶液、1.0 mL衍生試劑按照1.3.4節(jié)樣品前處理步驟衍生化處理后，注射泵直接進(jìn)樣，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)注入質(zhì)譜。8 種生物胺中均含有氨基，為極性堿性化合物，在結(jié)構(gòu)上氮原子具有孤對電子，容易加合質(zhì)子形成帶正電荷的離子，在正離子模式掃描模式下響應(yīng)值較高[29]，因此選擇在電噴霧正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，確定母離子質(zhì)量數(shù)，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、噴霧電壓、鞘氣等參數(shù)，使母離子響應(yīng)值達(dá)到最高，然后對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，使子離子響應(yīng)值達(dá)到最高，得到多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）下的最佳離子對。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1 mol/L鹽酸溶液配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃保存，保存期為6 個月。分別吸取1 mL的單組分生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度100 mg/L的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃保存，保存期為3 個月。準(zhǔn)確吸取上述生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋成終質(zhì)量濃度為1、20、50、100、250、500、1 000 ng/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（1,7-二氨基庚烷）適量，用0.1 mol/L的鹽酸溶液配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃保存，保存期為6 個月。準(zhǔn)確吸取上述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用0.1 mol/L的鹽酸溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度250 ng/mL的內(nèi)標(biāo)使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 樣品前處理

準(zhǔn)確量取1.0 mL黃酒樣品、250 μL質(zhì)量濃度250 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液、1.0 mL飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 1 mol/L氫氧化鈉溶液、1.0 mL衍生試劑（丹磺酰氯溶液質(zhì)量濃度10 mg/mL）于10 mL塑料連蓋離心管中，旋渦混勻1 min，60 ℃恒溫水浴15 min后取出加入100 μL氨水，旋渦混勻，60 ℃水浴反應(yīng)15 min，取出，冷卻10 min，加入1.0 mL超純水，旋渦混勻，氮?dú)獯等ケ?，加?.5 g氯化鈉，振蕩至完全溶解，加入5 mL乙酸乙酯，充分混勻后靜置分層，吸取上層有機(jī)相，下層水相重復(fù)萃取1 次，合并2 次制得的有機(jī)相，氮吹至干。加入1.0 mL乙腈復(fù)溶，用0.22 μm濾膜針頭濾器過濾，收集濾液，待測[30]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜的采集采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2019 b軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

離子源掃描模式：電噴霧正離子模式；監(jiān)測模式：MRM；氮?dú)鉃檩d氣；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：12 L/min；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L/min；霧化氣壓力：241 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：500 V；質(zhì)譜參數(shù)的駐留時間均為75 s、錐孔電壓均為25 V、加速電壓均為3 V；組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、亞精胺、精胺共8 種生物胺的定性、定量離子對中的母離子分別為m/z579、605、556、570、394、355、423、568，子離子均為m/z170。

2.2 色譜條件優(yōu)化

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱采用橋式亞乙基雜化顆粒技術(shù)，對生物胺有良好的保留作用，并具有極高的分離效率，可以獲得更快的分析速度與更高的靈敏性。分別選擇純水和甲醇、純水和乙腈、0.1%甲酸和0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作為流動相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇的分離效果更好，流動相內(nèi)加入0.1%甲酸后出現(xiàn)的峰形更好，無嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，因此，選用0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作為流動相。8 種生物胺的總離子流圖如圖1所示。

圖1 8 種生物胺的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of eight biogenic amines

2.3 萃取試劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較分別用乙醚和乙酸乙酯萃取同一個樣品的結(jié)果，結(jié)果如圖2所示。2 種萃取劑均可將生物胺萃取出來，萃取效果無顯著差異，但考慮到乙醚的毒性較大，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為生物胺萃取溶劑。

圖2 不同萃取劑對生物胺組別萃取效果的影響Fig. 2 Effect of different extraction agents on the extraction efficiency of biogenic amines

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

分別配制終質(zhì)量濃度為1、2、50、100、250、500、1 000 ng/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生化處理后，進(jìn)行測定，以各生物胺質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)生物胺與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比作為縱坐標(biāo)，繪制各生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性方程與線性相關(guān)系數(shù)。以信噪比為3作為檢出限，信噪比為10作為定量限，測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，8 種生物胺的線性方程的線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.995 1，在各自線性范圍內(nèi)線性良好，檢出限在0.25～0.50 ng/mL之間，定量限在1～2 ng/mL之間。均優(yōu)于GB 5009—2016《食品中生物胺的測定》[30]中的檢出限（2～5 mg/L）和定量限（5～10 mg/L）。

表1 8 種生物胺的線性方程、檢出限與定量限Table 1 Linear equations, limits of detection and quantitation for eight biogenic amines

2.5 精密度

精密度分為日內(nèi)精密度和日間精密度，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。分別選取低、中、高3 個質(zhì)量濃度（50、300、500 ng/mL）的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品前處理步驟衍生化處理后，進(jìn)行分析，3 個質(zhì)量濃度的樣品在24 h內(nèi)每隔2 h重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各生物胺質(zhì)量濃度RSD，記為日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算3 d內(nèi)各生物胺質(zhì)量濃度RSD，記為日間精密度，測定結(jié)果見表2。8 種生物胺的日內(nèi)精密度在0.61%～5.68%之間，日間精密度在0.82%～5.00%之間，具有良好的精密度和準(zhǔn)確性。

表2 測定8 種生物胺方法的日內(nèi)和日間精密度Table 2 Intra-day and inter-day precision of the method for the determination of eight biogenic amines

2.6 樣品加標(biāo)回收率

取同種黃酒樣品3 份，稀釋50 倍分別向其中加入質(zhì)量濃度分別為30、100、200 ng/mL的生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品前處理步驟衍生處理后，每個水平平行測定6 次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果見表3。8 種生物胺的平均加標(biāo)回收率在83.56%～117.45%之間，RSD均小于6.69%。

表3 黃酒中生物胺的平均加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 3 Average recoveries and RSDs of eight biogenic amines from spiked Huangjiu (n = 6)

2.7 實(shí)際樣品的測定

按照上述方法對10 個市售黃酒樣品進(jìn)行檢測，10 個樣品中均未檢出色胺與精胺。10 個樣品均檢出組胺、腐胺和亞精胺，質(zhì)量濃度分別為1.42～8.05、0.80～15.69 μg/mL和0.06～0.53 μg/mL，具體見表4。

表4 黃酒樣品中生物胺的含量Table 4 Biogenic amine contents in Huangjiu samples determined by the method

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜的方法同時檢測黃酒中8 種生物胺。該方法采用丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生，液-液萃取后結(jié)合內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可在19 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)黃酒中8 種生物胺的定量分析，其具有分析速度快、靈敏度高與重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于我國黃酒產(chǎn)品的質(zhì)量控制和安全評價(jià)。