多重real-time PCR技術(shù)快速鑒別特種乳中的乳源動(dòng)物成分

楊艷歌，李 莉，王丹丹，李唯熙，王洪越，劉鳴暢，吳亞君,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038）

目前乳產(chǎn)品市場(chǎng)朝著多樣化方向快速發(fā)展，羊乳、牦牛乳、水牛乳、駱駝乳、馬乳、驢乳等特色乳產(chǎn)品越來越受到關(guān)注。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織的數(shù)據(jù)顯示，全球生鮮乳生產(chǎn)量排名前5的分別為牛奶（占81%）、水牛奶（占15%）、山羊奶（占2%）、綿羊奶（占1%）以及駱駝奶（占0.5%）[1]。我國(guó)乳品資源豐富，加上產(chǎn)業(yè)政策的扶持，特色乳產(chǎn)業(yè)逐漸成為南方和西部地區(qū)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的亮點(diǎn)。同時(shí)牦牛乳[2-3]、山羊乳[4]、驢乳[5]和馬乳[6]等乳品在營(yíng)養(yǎng)素含量上更接近人乳，逐漸受到消費(fèi)者青睞。

由于特色乳的數(shù)量和日產(chǎn)量較小，價(jià)格偏高[7-8]，容易發(fā)生摻假摻雜現(xiàn)象，主要是用價(jià)格相對(duì)較低的牛乳替代或添加到特色乳，這不僅侵犯了消費(fèi)者的權(quán)益，而且容易引起過敏[9]等健康風(fēng)險(xiǎn)。因此各種乳源可追溯性分析方法陸續(xù)涌現(xiàn)，有基于免疫的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù)[10-12]，基于非免疫的液相色譜[13-14]、電泳[15-17]或質(zhì)譜技術(shù)[18-20]等。而基因檢測(cè)技術(shù)是被公認(rèn)的物種鑒定金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，并具有可靠、特異、靈敏、快速的特點(diǎn)[21-23]。自發(fā)現(xiàn)牛奶中體細(xì)胞可以被用作DNA的來源后[24]，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）為基礎(chǔ)的乳源物種識(shí)別技術(shù)迅速發(fā)展，其中實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）操作簡(jiǎn)便，無(wú)需電泳即可自動(dòng)化獲得檢測(cè)結(jié)果，并進(jìn)行快速定性定量分析[25-27]。而多重realtime PCR還可以在一次反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速高通量的檢測(cè)[21,25,28]。

本研究建立可通過一次實(shí)驗(yàn)，高通量、高效率鑒別乳品中8 種乳源成分（牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝、馬、驢）的多重real-time PCR方法，同時(shí)篩選建立乳品DNA高效提取方法，完成裂解后在12 min左右可同時(shí)進(jìn)行96 個(gè)樣品的DNA提取，大大縮短了樣品前處理時(shí)間。該方法的建立旨在為特種乳監(jiān)管提供可靠有力、快速高效的檢測(cè)手段，為打擊假冒偽劣產(chǎn)品，保障消費(fèi)者生命健康提供良好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

綿羊乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳均從內(nèi)蒙古的牧場(chǎng)收集，水牛乳、驢乳、牦牛乳分別由廣西水牛研究所、山東海關(guān)和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，全脂牛乳粉由惠氏營(yíng)養(yǎng)品有限公司提供。市售特色乳制品購(gòu)自北京超市以及電商平臺(tái)。其他動(dòng)物材料：豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂、雞、鴨、魚為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存樣品。

1.1.2 試劑

QuickGene組織DNA提取試劑盒 日本Kurabo公司；PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒 英國(guó)MicroGEM公司；NucleoSpin?食品DNA提取試劑盒 德國(guó)Macherey-Nagel公司；DNeasy Mericon DNA提取試劑盒德國(guó)Qiagen公司；Foodproof?轉(zhuǎn)基因樣品提取試劑盒德國(guó)Biotecon Diagnostics公司；TaqMan?Gene Expression Master Mix 美國(guó)Applied Biosystems公司；滅菌ddH2O。

1.1.3 引物探針

牛、水牛、牦牛、綿羊的引物探針序列引自現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)[29-32]。哺乳動(dòng)物、駱駝、山羊、馬、驢引物探針自行設(shè)計(jì)，先從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提取這些物種及各自近源物種的生長(zhǎng)激素基因（growth hormone，GH）、cytb、tRNA-Thr及D-loop基因序列，然后利用Clustal X軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用Primer Premier 5.0軟件在保守區(qū)域設(shè)計(jì)哺乳動(dòng)物通用引物探針，在種間差異區(qū)域設(shè)計(jì)駱駝、山羊、馬、驢的特異性引物探針。考慮到乳粉在生成過程中需要經(jīng)過高溫殺菌等加工處理，會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂或者降解，因此在設(shè)計(jì)篩選引物探針時(shí)控制靶序列長(zhǎng)度在250 bp以內(nèi)，以保證不同加工程度乳品的檢測(cè)需求。設(shè)計(jì)的引物探針通過單重real-time PCR進(jìn)行物種特異性和靈敏度進(jìn)行分析，最終確定的引物探針信息詳見表1。引物探針均由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 乳源動(dòng)物成分檢測(cè)引物探針信息Table 1 Information about primers and probes used for identification of dairy animal species

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司；QuickGene Mini8L 日本Kurabo公司；核酸蛋白定量?jī)xQubit?2.0美國(guó)Invitrogen公司；組織研磨機(jī) 德國(guó)Qiagen公司；渦旋儀 德國(guó)IKA公司；Pico17離心機(jī)（離心力≥12 000×g） 美國(guó)Thermo公司；恒溫混勻儀、微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；離心管、八連排PCR管美國(guó)Axygen公司；電子天平 德國(guó)Sartorius公司；恒溫水浴鍋 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

液態(tài)乳冷凍干燥成粉，乳粉直接混勻，其他植物和動(dòng)物樣品統(tǒng)一用組織研磨儀粉碎，-80 ℃凍存。

1.3.2 DNA提取

CTAB法采用GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法》[33]操作，其中蛋白酶K量增加1 倍，氯仿去蛋白的步驟重復(fù)1 次。PDQeX prepGEM通用DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取DNA。而NucleoSpin、DNeasy Mericon、QuickGene、Foodproof DNA提取試劑盒在說明書的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良：樣品量統(tǒng)一稱取100 mg，蛋白酶K量增加1 倍，裂解時(shí)間統(tǒng)一為65 ℃、500 r/min恒溫混勻儀振蕩孵育1 h，其余步驟按說明書操作。DNA用100 μL無(wú)菌ddH2O溶解。用Qubit?2.0測(cè)量DNA濃度，用篩選的哺乳動(dòng)物內(nèi)參照基因進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，每份DNA擴(kuò)增3 次，-20 ℃保存DNA。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)選的方法進(jìn)行DNA提取。

1.3.3 real-time PCR擴(kuò)增

單重real-time PCR體系：總體積25 μL包含12.5 μLTaqMan?Gene Expression Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL（5 ng/μL），無(wú)菌ddH2O 6 μL。

多重real-time PCR體系：4 種不同熒光的濃度為10 μmol/L的上游、下游引物和探針分別按照1∶1∶1∶1混合配制成上下游引物混合液以及探針混合液，對(duì)應(yīng)的4 種靶標(biāo)乳粉DNA（5 ng/μL）等體積混合配成DNA mix?？傮w積25 μL包含12.5 μLTaqMan? Multiplex Master Mix，上游引物、下游引物和探針混合液各1 μL，DNA混合液5 μL，無(wú)菌ddH2O 4.5 μL。

在real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增與結(jié)果分析。擴(kuò)增程序：50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s， 60 ℃退火1 min，40 個(gè)循環(huán)（哺乳50 個(gè)循環(huán)）。生成圖像時(shí)閾值設(shè)為自動(dòng)。在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。

1.3.4 引物探針通用性和特異性

分別以綿羊奶、山羊奶、牛乳、水牛乳、牦牛乳、駱駝乳、馬奶、驢乳、馬鹿、梅花鹿、豬、狗、兔、狐貍、水貂、雞、鴨、魚的DNA（5 ng/μL）為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.5 多重real-time PCR交叉反應(yīng)性

按照real-time PCR儀的4 種熒光系統(tǒng)，對(duì)8 種乳源的探針分別用FAM、VIC、ABY和JUN進(jìn)行熒光標(biāo)記并編號(hào)，編號(hào)如表1所示。根據(jù)發(fā)光集團(tuán)的不同將8 種乳源進(jìn)行組合，共產(chǎn)生16 種組合：即1234、1247、1238、1278、1346、1368、1467、1678、2345、2358、2457、2578、3456、3568、4567、5678。8 種乳DNA均調(diào)至5 ng/μL，將每種組合對(duì)應(yīng)的4 種DNA進(jìn)行等體積混合作為陽(yáng)性（DNA終質(zhì)量濃度1.25 ng/μL），10 種陰性對(duì)照DNA調(diào)至12.5 ng/μL并進(jìn)行等體積混合作為陰性對(duì)照（保證反應(yīng)體系中每個(gè)物種終質(zhì)量濃度一致），以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.6 多重real-time PCR絕對(duì)靈敏度

將提取的8 種乳樣品的DNA從起始質(zhì)量濃度開始進(jìn)行10 倍比稀釋，稀釋6 個(gè)梯度，其中牛乳和馬乳起始DNA質(zhì)量濃度為5 ng/μL，水牛乳和驢乳起始DNA質(zhì)量濃度為10 ng/μL，牦牛乳、山羊乳、駱駝乳起始DNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL，綿羊乳起始DNA質(zhì)量濃度為100 ng/μL。以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，用優(yōu)選的組合進(jìn)行多重realtime PCR擴(kuò)增，分析檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.7 實(shí)際靈敏度分析

為分析建立的多重real-time PCR體系對(duì)混合樣品檢測(cè)的靈敏度，將每種組合對(duì)應(yīng)的4 種靶標(biāo)乳先等質(zhì)量混合，以非靶標(biāo)乳為基質(zhì)，按照每種靶標(biāo)乳含量0.1%、1%、10%、50%的比例制備混合乳品。即以綿羊乳為基質(zhì)添加牛乳/牦牛乳/水牛乳/山羊混合乳，以牛乳為基質(zhì)添加綿羊乳/驢乳/馬乳/駱駝乳混合乳，以對(duì)應(yīng)的基質(zhì)DNA為陰性對(duì)照，以ddH2O為空白對(duì)照，對(duì)目標(biāo)物種成分進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

從儀器導(dǎo)出檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)，并錄入在Excel表格中，在Excel中計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制三線表、柱形圖或散點(diǎn)圖，柱形圖用不同顏色和圖案填充，以重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差添加誤差線。擴(kuò)增圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動(dòng)生成，導(dǎo)出圖譜進(jìn)行組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳品高效DNA提取方法的建立

為實(shí)現(xiàn)乳品DNA的快速高效提取，以牛乳和羊乳為研究對(duì)象，選用傳統(tǒng)CTAB法和5 種商業(yè)試劑盒比較和優(yōu)化DNA提取方法，通過質(zhì)量濃度、純度和哺乳動(dòng)物內(nèi)參照基因檢測(cè)結(jié)果分析DNA提取質(zhì)量和擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示，針對(duì)牛乳，DNeasy Mericon DNA試劑盒提取的DNA濃度最高，其次是QuickGene組織DNA提取試劑盒，二者的擴(kuò)增效率幾乎一致。針對(duì)羊乳，無(wú)論是DNA提取質(zhì)量濃度還是擴(kuò)增效率，QuickGene都高于其他5 種方法。

并且QuickGene DNA組織提取試劑盒配套QuickGene-mini8L設(shè)備，通過溫和正壓過柱法從樣品中快速獲取DNA，無(wú)需離心，對(duì)核酸片段的損傷小；一次可過柱10 mL的液體，是傳統(tǒng)吸附柱法15 倍的體積量，大大縮短了富集時(shí)間，樣品裂解后12 min即可完成DNA提?。磺铱梢砸淮瓮瑫r(shí)處理8 份樣品，提高了提取的通量。因此最終選擇QuickGene組織DNA提取試劑盒作為不同乳制品DNA快速高效提取的方法。

圖1 不同DNA提取方法對(duì)乳DNA提取結(jié)果Fig. 1 Results of DNA extraction from milk by different DNA extraction methods

2.2 引物探針的篩選

為保證real-time PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，首先要保證提取的乳品DNA的質(zhì)量。因?yàn)槌Ｒ姷娜樵次锓N均為哺乳動(dòng)物，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選了哺乳動(dòng)物通用引物探針。real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，該引物探針可以將15 種哺乳動(dòng)物成分（綿羊、山羊、牛、水牛、牦牛、駱駝、馬、驢、豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂）擴(kuò)出，Ct值均在30以內(nèi)，非哺乳動(dòng)物無(wú)擴(kuò)增，表明通用性和特異性良好，可以作為乳品DNA質(zhì)量檢測(cè)的內(nèi)參照。

以8 種乳為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)和篩選8 種乳源（牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝、馬、驢）的特異性引物探針（表1），擴(kuò)增結(jié)果顯示只有靶標(biāo)乳源物種產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增Ct值在19.96～25.86之間（表2），與非靶標(biāo)乳源物種之間無(wú)交叉反應(yīng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照也均無(wú)擴(kuò)增，說明篩選的引物探針特異性較好。

表2 通用性和特異性引物探針real-time PCR檢測(cè)結(jié)果（ ）Table 2 Results of real-time PCR detection using universal and specific primers and probes ()

表2 通用性和特異性引物探針real-time PCR檢測(cè)結(jié)果（ ）Table 2 Results of real-time PCR detection using universal and specific primers and probes ()

注：a.指豬、梅花鹿、馬鹿、狗、兔、狐貍、水貂；b.指雞、鴨、魚。

樣品水牛 23.67±0.2520.39±0.28牦牛 22.93±0.5324.02±0.41山羊 22.15±0.1725.86±0.64綿羊 22.20±0.28 Ct值哺乳 牛 水牛 牦牛 山羊 綿羊 馬 驢 駱駝牛 21.24±0.0419.96±0.03 ≥40≥40≥40≥40≥40≥40≥40 20.96±0.29馬 22.32±0.22 24.43±0.35哺乳非靶標(biāo)a21.43～29.18≥40非哺乳b ≥50≥40≥40 20.27±0.10駱駝 26.49±0.09≥40 20.30±0.54驢 20.07±0.11≥40≥40≥40≥40

2.3 多重real-time PCR交叉反應(yīng)性

為建立乳源多重real-time PCR檢測(cè)體系，對(duì)8 種乳源引物探針的16 種組合進(jìn)行多重real-time PCR交叉反應(yīng)性檢測(cè)。結(jié)果顯示，除2358這種組合外，其他15 種組合均能成功檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的4 個(gè)目標(biāo)物種（圖2），10 種陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增。但發(fā)現(xiàn)含牦牛成分的3 種組合中（1238、1346和2345）牦牛的擴(kuò)增曲線ΔRn較低，非典型的S型曲線（圖2C、E和圖I）；同時(shí)1247和2457組合中山羊（圖2B和K），以及1278和2578中駱駝的擴(kuò)增也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象（圖2D和L），說明在這8 種組合中出現(xiàn)了交叉反應(yīng)，擴(kuò)增受到抑制。剩下的反應(yīng)體系中只有1234和5678這種組合可以同時(shí)保證8 種乳源均具有良好的擴(kuò)增效果（圖2A和P），混合體系之間未產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故初步確定以1234和5678這種組合作為8 種乳源多重real-time PCR檢測(cè)體系。

圖2 16種組合的多重real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Amplification curves with 16 multiplex combinations of four primers and four probes

2.4 多重real-time PCR絕對(duì)靈敏度

為對(duì)選擇的1234和5678這種組合的多重檢測(cè)體系進(jìn)行絕對(duì)靈敏度分析，將8 種乳稀釋的6 個(gè)梯度進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)，每一個(gè)物種的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示馬乳（圖3C）、牛乳（圖3D）和駱駝乳（圖3G）DNA前5 個(gè)濃度擴(kuò)增結(jié)果較好，但第6個(gè)梯度的擴(kuò)增曲線接近閾值基線，故牛乳和馬乳的最低絕對(duì)靈敏度為0.5 pg/μL，駱駝為5 pg/μL；水牛乳、綿羊乳和驢乳DNA可以檢測(cè)到第6個(gè)濃度梯度，故水牛乳和驢乳的最低絕對(duì)靈敏度為0.1 pg/μL，綿羊乳最低絕對(duì)靈敏度為1 pg/μL；牦牛乳和山羊乳可以檢測(cè)到5 個(gè)濃度梯度，即最低絕對(duì)靈敏度均為5 pg/μL。分析儀器自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，如圖4所示，R2均在0.99以上，擴(kuò)增效率均在80%以上，說明線性關(guān)系良好，檢測(cè)結(jié)果較可靠。

圖3 8種乳源多重real-time PCR絕對(duì)靈敏度擴(kuò)增圖譜和數(shù)據(jù)分析Fig. 3 Amplification curves showing absolute sensitivity of multiple real-time PCR for detection of milks from eight dairy species

圖4 8種乳源多重real-time PCR絕對(duì)靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Fig. 4 Standard curves for absolute sensitivity of multiple real-time PCR for detection of milks from eight dairy species

2.5 多重real-time PCR檢出限

為了進(jìn)一步分析1234與5678組合的多重realtime PCR體系對(duì)混合乳品檢測(cè)的實(shí)際靈敏度，制備了4 種目標(biāo)乳含量為0.1%、1%、10%、50%的混合樣品，多重real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示8 種乳的檢出限均可達(dá)0.1%，檢測(cè)Ct值在32.05～38.07之間（圖5），可以滿足檢測(cè)需求。因此確定后續(xù)實(shí)際乳品檢測(cè)以1234與5678這種多重real-time PCR體系進(jìn)行乳品中8 種乳源成分的檢測(cè)。

圖5 混合乳品多重real-time PCR實(shí)際檢出限Fig. 5 Limits of detection of multiplex real-time PCR for milk mixtures

2.6 市售樣品檢測(cè)結(jié)果

用建立的方法對(duì)55 份樣品市售特色乳產(chǎn)品進(jìn)行了乳源成分分析，包括12 份牦牛乳制品、4 份水牛乳制品、11 份駱駝乳制品、4 份馬乳制品、5 份驢乳制品、9 份山羊乳制品、6 份綿羊乳制品以及4 份未標(biāo)識(shí)羊品種的羊乳制品。種類包括液態(tài)鮮奶、酸奶、奶貝/奶片、奶酪/干酪、奶粉、嬰配，涉及的加工方式包括巴氏殺菌、發(fā)酵、高溫滅菌、超高溫滅菌、高溫噴霧干燥、物理脫膻、凍干、低溫干燥、低溫干濕復(fù)合等。用哺乳動(dòng)物內(nèi)參照進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示所有乳制品檢測(cè)Ct值均在35以內(nèi)，證明建立的DNA提取方法可以滿足不同種類不同加工方式乳制品基因檢測(cè)的需求。多重realtime PCR進(jìn)行8 種乳源成分的檢測(cè)結(jié)果顯示（表3），有20 份乳制品檢出非標(biāo)識(shí)物種成分，摻偽率達(dá)36.36%，主要是羊乳制品、駱駝乳制品及牦牛乳制品。其中5 份山羊乳制品檢出非標(biāo)識(shí)綿羊或牛成分，不符率為55.56%；3 份綿羊乳制品檢出非標(biāo)識(shí)山羊或牛成分，不符率為50%；另有1 份馬乳制品、1 份驢乳制品、6 份駱駝乳制品、4 份牦牛乳制品檢出非標(biāo)識(shí)牛成分，不符率分別為25%、20%、54.54%、33.33%。水牛乳制品和未標(biāo)識(shí)品種的羊乳制品未檢出非標(biāo)識(shí)成分。整體市售特色乳產(chǎn)品乳源標(biāo)識(shí)不符率達(dá)36.36%。

表3 市售乳及乳制品乳源動(dòng)物物種成分檢測(cè)Table 3 Results of detection of animal-derived ingredients from commercial dairy products from minor species

續(xù)表3

3 討 論

分離提取高質(zhì)量的DNA是基因檢測(cè)的首要原則，從乳品中提取DNA主要從體細(xì)胞中獲得，而每毫升乳中僅有20～20萬(wàn) 個(gè)體細(xì)胞，DNA含量不高[24,34]。加之乳制品在生成過程中需要經(jīng)過噴霧干燥、高溫殺菌等加工處理，會(huì)導(dǎo)致DNA斷裂或者降解，加劇了DNA提取的難度[35]。因此建立乳品中高效快速的DNA提取方法，對(duì)乳品的乳源檢測(cè)具有重要意義。通過比較，QuickGene DNA提取試劑盒不僅半自動(dòng)、高通量，且相比于傳統(tǒng)試劑盒法具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）移液快，具有10 mL容量的富集柱遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)富集柱650 μL的容量；2）DNA損傷小，即用正壓過濾而無(wú)需高速離心；3）損失少，即1 次過柱即可完成過濾，而傳統(tǒng)試劑盒需多次轉(zhuǎn)移。另外乳品蛋白質(zhì)含量高，這不僅給DNA提取帶來困難，也會(huì)抑制PCR，降低檢測(cè)的靈敏度[36-37]，蛋白酶K可以水解消化蛋白質(zhì)，因此提高了蛋白酶K的濃度和作用時(shí)間以增強(qiáng)水解作用。但水解時(shí)間過長(zhǎng)，又會(huì)導(dǎo)致部分核酸消耗；過高濃度的蛋白酶K也會(huì)引起部分核酸的消耗，增加不必要的實(shí)驗(yàn)成本[38]。因此經(jīng)過優(yōu)化（數(shù)據(jù)未提供），普通乳品蛋白酶K的用量提高至試劑盒濃度高2 倍；奶酪制品蛋白酶K用量是試劑盒濃度3 倍時(shí)效果最好，該方法保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不同種類不同加工方式乳制品DNA的成功提取，說明了優(yōu)化方法對(duì)于乳制品的適用性。

本研究設(shè)計(jì)篩選的8 種乳源物種探針采用TaqMan QSY標(biāo)記，該方法的優(yōu)點(diǎn)是可將已進(jìn)行單重realtime PCR篩選后的探針，在不改變序列的情況下直接平移到QSY探針上，減少了傳統(tǒng)多重real-time PCR探針設(shè)計(jì)和篩選的工作量。且采用該體系，設(shè)計(jì)的引物探針既可進(jìn)行單重也可進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)。同時(shí)5′熒光基團(tuán)為FAM、VIC、ABY、JUN，避免了黯淡的染料Cy5或Quasar 705熒光信號(hào)低，靈敏度低的情況。本研究還采用了TaqMan? Multiplex Master Mix多重real-time PCR擴(kuò)增酶，該酶采用MUSTANG PURPLE染料作參比熒光而不含ROX，可避免占據(jù)PCR儀紅色熒光通道，提高了反應(yīng)的靈敏度。最終通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)該方法特異性好、靈敏度高，檢測(cè)核酸含量可達(dá)pg級(jí)。

采用建立的多重real-time PCR法，對(duì)55 份市售的乳品進(jìn)行物種來源檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)嬰幼兒配方粉普遍存在乳源標(biāo)識(shí)不符的情況，達(dá)到85.7%。除了蓄意摻假，標(biāo)識(shí)以外物種成分的來源還可能是乳糖等配料。本實(shí)驗(yàn)室采用real-time PCR法對(duì)牛來源的乳糖檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性信號(hào)（結(jié)果未發(fā)表）。因此，當(dāng)應(yīng)用real-time PCR法檢測(cè)乳品動(dòng)物來源時(shí)，對(duì)于成分復(fù)雜的產(chǎn)品，可以考慮進(jìn)一步使用蛋白質(zhì)分析方法確證動(dòng)物成分是否來源原料乳。本實(shí)驗(yàn)室也建立了乳源蛋白雙向電泳檢測(cè)方法[39-40]，可通過圖譜直觀地呈現(xiàn)乳品中主要蛋白質(zhì)，但蛋白分析方法操作步驟復(fù)雜、比較耗時(shí)、靈敏度相對(duì)較低。因此，多重real-time PCR法作為高效篩查技術(shù)，可以應(yīng)用于含有其他動(dòng)物來源成分產(chǎn)品的快速篩選，對(duì)具體成分可以通過電泳、色譜、質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)一步鑒定，從而提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。