鮮食玉米籽粒發(fā)育期間污染真菌分離鑒定及真菌毒素含量分析

張娜娜，陳利容，張守梅，郭玉秋，劉開(kāi)昌，龔魁杰

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟(jì)南 250100）

鮮食玉米是指在乳熟期即玉米授粉后22～26 d采摘的玉米。相比于普通玉米，鮮食玉米淀粉含量低，蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素以及磷、鐵、鈣等微量元素含量更為豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。鮮食玉米是一種優(yōu)秀的全谷物食品，其營(yíng)養(yǎng)健康價(jià)值和公眾可接受性都遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)粒用玉米[3]。我國(guó)鮮食玉米2018年種植面積已達(dá)1 700萬(wàn) 畝，市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到500億 元以上，已經(jīng)發(fā)展成為獨(dú)具中國(guó)特色的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。與蓬勃發(fā)展的產(chǎn)業(yè)相比，隱藏在鮮食玉米背后的質(zhì)量安全問(wèn)題，卻還沒(méi)有引起廣泛關(guān)注，成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)隱患。

由于胚部較大、營(yíng)養(yǎng)豐富，多數(shù)玉米在收獲前就已被霉菌侵染[4-5]。而在玉米生長(zhǎng)期間，除了種子攜帶的病原菌，空氣、土壤、昆蟲(chóng)等傳播途徑，都會(huì)使玉米籽粒發(fā)育期間極易受到致病真菌侵染，導(dǎo)致穗腐病、絲黑穗病、瘤黑粉病等果實(shí)病變[6]。有些產(chǎn)毒真菌如曲霉屬、鐮孢屬、青霉屬等附著在玉米籽粒表面進(jìn)而入侵籽粒內(nèi)部，在適宜的條件下就會(huì)產(chǎn)生如黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素，積累到一定量即可危及人和牲畜的生命安全，因此，玉米的質(zhì)量安全問(wèn)題近年來(lái)一直受到廣泛關(guān)注，我國(guó)和歐盟均對(duì)真菌毒素在食品尤其是糧食作物中的限量作出規(guī)定[7-8]。鮮食玉米由于生長(zhǎng)期短，且直接食用，因此，其質(zhì)量安全狀況更應(yīng)引起高度重視。

有研究發(fā)現(xiàn)，不同品種鮮食玉米干基淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪含量差異不大[2]，但不同色澤鮮食玉米的類(lèi)胡蘿卜素、花色苷、酚類(lèi)化合物含量存在顯著差異，由此導(dǎo)致抗氧化活性和抗菌性也存在顯著差異[9-10]。因此，本研究選用當(dāng)前3 個(gè)代表性的鮮食糯玉米品種天紫23、京科糯2000和黑糯6號(hào)，籽粒色澤分別為紫色、白色和黑色。通過(guò)對(duì)比不同色澤品種在不同發(fā)育時(shí)期真菌污染和真菌毒素積累情況，掌握鮮食玉米適宜采收期的總體質(zhì)量安全情況，并分析不同品種特征鮮食糯玉米的真菌污染和毒素積累差異，以期為鮮食糯玉米品種選育和實(shí)際生產(chǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食玉米樣品采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)示范基地濟(jì)陽(yáng)基地，3 個(gè)品種為天紫23、京科糯2000、黑糯6號(hào)，每個(gè)品種花期套袋后，進(jìn)行人工授粉。本實(shí)驗(yàn)從玉米授粉期當(dāng)天開(kāi)始，以授粉后天數(shù)（days after pollination，DAP）表示每次取樣時(shí)期，根據(jù)玉米籽粒發(fā)育程度從籽粒開(kāi)始授粉、灌漿、乳熟、蠟熟、完熟時(shí)界定取樣時(shí)間為0 DAP、12 DAP、23 DAP、35 DAP、55 DAP為采樣期，隨機(jī)取樣，為保證所取果穗的一致性，采收時(shí)選擇生長(zhǎng)發(fā)育一致的植株，無(wú)蟲(chóng)害和霉變，每個(gè)品種每次帶苞葉取30～50 個(gè)果穗，裝入無(wú)菌密封袋中，取樣后放入箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天取樣當(dāng)天分離。在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌鑷子剝除苞葉，進(jìn)一步選擇無(wú)蟲(chóng)害、霉變果穗20 個(gè)，剝?nèi)∮衩姿胫虚g位置籽粒，共取籽粒鮮質(zhì)量200 g，混勻后無(wú)菌粉碎至全部過(guò)20 目篩，一部分用來(lái)分離病原菌，一部分-80 ℃低溫貯存，用于測(cè)定毒素。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；青鏈霉素（青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 mg/mL） 以色列生物工業(yè)有限公司；丙三醇（甘油）、乙二胺四乙酸、無(wú)水磷酸二氫鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×TaqDNA Master Mix、ITS通用引物 北京擎科生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、10 000×DNA Dye 北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮ELISA檢測(cè)試劑盒 北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；IX51倒置顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；LXJ-IIB型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3E酸度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；SHA_B型數(shù)顯恒溫振蕩水浴器 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；DTC-100型恒溫金屬浴 杭州米歐儀器有限公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）公司；5425型號(hào)臺(tái)式高速離心機(jī)艾本德（中國(guó)）有限公司；T960型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海力新儀器有限公司；Min-Sub Cell水平電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；NU Genius凝膠成像系統(tǒng) 香港基因有限公司；GL124-1SCN分析天平 德國(guó)賽得利斯（中國(guó)）公司；XW-80A旋渦混合儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 真菌分離、純化

在超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下，取1 g樣品于含有10 mL滅菌蒸餾水的離心管中，渦旋振蕩10 s充分混勻。采用稀釋平板法[11]，取1 mL混合液于9 mL滅菌蒸餾水中依次稀釋成10-2、10-3、10-4濃度梯度的混合液。取100 μL稀釋液涂布于含有1%青霉素（10 000 U/mL）和硫酸鏈霉素（10 mg/mL）的無(wú)菌PDA平板培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度梯度做3 個(gè)重復(fù)。將接種后的平皿28 ℃左右培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。根據(jù)菌落形態(tài)對(duì)真菌進(jìn)行純化并編號(hào)，并用無(wú)菌保種管4 ℃保存。

1.3.2 真菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)觀察：包括菌落大小、菌落顏色、高度、菌絲長(zhǎng)短、氣生菌絲質(zhì)地（絨毛狀、棉絮狀、粉粒狀、氈狀或毯狀等）、菌落表面紋飾（皺紋、輻射溝紋或同心紋）、菌落背面顏色及是否產(chǎn)生色素。

顯微鑒定：制作臨時(shí)裝片，在干凈的載玻片中央滴一滴無(wú)菌水，用無(wú)菌接種針挑取少量經(jīng)過(guò)純化的菌絲和孢子于無(wú)菌水滴中，小心從邊緣位置蓋好蓋玻片，并排出氣泡，置于倒置攝像顯微鏡下，觀察菌絲表面形狀、是否有隔、分生孢子梗分支情況、輪生或單生、基部粗糙或光滑等，孢子形態(tài)、大小、著生位置（單生或互生）、表面形態(tài)等[12]。

1.3.3 真菌分子生物學(xué)鑒定

選取形態(tài)不同的代表性菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

真菌DNA基因組提取：采用熱裂解法[13]，用無(wú)菌接種針挑取少量菌絲放到盛有100 μL超純水的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min，充分混勻。10 000 r/min離心30 s，用微量移液器小心棄去上清液。在離心管中加入100 μL裂解液，封口膜封口后放入85 ℃金屬浴20～30 min。粗提物中含有真菌的基因組DNA，放入20 ℃保存?zhèn)溆?。裂解液成分?0 mmol/L的磷酸二氫鈉，1 mmol/L的乙二胺四乙酸和5%甘油，調(diào)節(jié)pH值到7.4，使用前121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，4 ℃貯藏備用。

核糖體DNA中ITS序列擴(kuò)增[14]：基于18S核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）的通用引物，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 PCR體系Table 1 Composition of PCR system

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有目的條帶，將產(chǎn)物送往青島擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

系統(tǒng)發(fā)育分析：對(duì)返回的測(cè)序結(jié)果用Geneious 8.0.3軟件進(jìn)行序列分析和校正，得到的高質(zhì)量DNA序列上傳到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中進(jìn)行同源序列BLAST比對(duì)，尋找具有較高同源性的核苷酸序列，初步確定其發(fā)育地位，并下載相似度高的菌種序列及序列號(hào)。將各類(lèi)菌株序列和比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA 7.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 真菌毒素檢測(cè)

黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.1 樣品處理

黃曲霉毒素B1：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g（鮮質(zhì)量），置入100 mL具塞三角瓶中，加入60%甲醇溶液25 mL于振蕩器轉(zhuǎn)速200 r/min，振蕩10 min；取液體于4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，再加入4 mL去離子水，渦旋混合5 s，最后調(diào)節(jié)pH值至7～8之間。

嘔吐毒素：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g（鮮質(zhì)量），置入100 mL具塞三角瓶中，加入25 mL去離子水，在150 r/min振蕩器上振蕩10 min充分混勻；取液體于4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL，再加入4 mL去離子水，渦旋混合5 s充分混勻。

玉米赤霉烯酮：粉碎并稱取鮮食玉米樣品5.0 g（鮮質(zhì)量），置入100 mL具塞三角瓶中，加入60%甲醇溶液50 mL于振蕩器轉(zhuǎn)速150 r/min，振蕩10 min充分混勻；取液體于4 000 r/min離心5 min，取上清液0.5mL，加入4.5 mL去離子水渦旋振蕩5 s充分混勻。

1.3.4.2 檢測(cè)步驟

將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔板編號(hào)，加入樣品和標(biāo)準(zhǔn)品50 μL/孔，再分別加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)物50 μL/孔，抗試劑50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板置25 ℃避光反應(yīng)30 min。揭開(kāi)蓋板膜，甩干液體，用對(duì)應(yīng)的毒素洗滌液250 μL/孔，洗滌4～5 次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干。依次加入底物顯色A液50 μL/孔和底物顯色B液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，蓋板膜蓋板25 ℃避光反應(yīng)15 min。加入終止液50 μL/孔，振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀分別于450 nm和630 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定每孔OD值。

1.3.4.3 結(jié)果判定

按下式計(jì)算吸光率：

式中：B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的OD值；B0為0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。

以標(biāo)準(zhǔn)品吸光率為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg/kg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣品的吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)即為樣本中真菌毒素實(shí)際含量。

1.3.4.4 試劑盒參數(shù)

試劑盒參數(shù)如表2所示。

表2 試劑盒參數(shù)Table 2 Parameters of ELISA kits

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理均測(cè)定3 次，取3 次平均值作為測(cè)定結(jié)果。采用Origin 9.0和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，取其平均值，運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）；產(chǎn)毒真菌與毒素積累相關(guān)性采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離真菌鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定

按照稀釋平板的梯度篩選法，本實(shí)驗(yàn)于鮮食玉米授粉后不同時(shí)期，從天紫23、京科糯2000和黑糯6號(hào)3 個(gè)品種中分離出1 606 株真菌，根據(jù)魏景超[15]的方法對(duì)真菌菌絲形態(tài)、菌落顏色和質(zhì)地及分生孢子顯微形態(tài)、大小等形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定，如圖1所示。

圖1 真菌在PDA平板的菌落及顯微（40×10）形態(tài)Fig. 1 Colonies and micromorphology (40 × 10) of fungi cultivated in PDA medium

2.1.2 分離真菌分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，選取具有不同形態(tài)的代表性菌株，進(jìn)行基于18S rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）鑒定，經(jīng)過(guò)基因組提取、通用引物ITS1和ITS4序列擴(kuò)增、1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，目的基因片段大小在500 bp左右，可以認(rèn)為，擴(kuò)增的目的片段為所需片段。

圖2 代表性真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis profile of PCR amplification products from representative fungi

將測(cè)序返回結(jié)果上傳到GenBank中進(jìn)行BLAST搜索，從中選擇已公開(kāi)發(fā)表且相似度最高的模式菌株，將序列和模式菌株序列導(dǎo)入MEGA 7.0軟件，采用最大似然法，迭代1 000 次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），確定各類(lèi)菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，最終確定所分離真菌分屬鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬、交鏈孢屬、籃狀菌屬、帚枝霉屬、枝孢屬、笄霉屬、橫梗霉屬、黑孢霉屬、莖點(diǎn)霉屬共計(jì)13 個(gè)屬20 個(gè)種（表3），編號(hào)為CN001～CN020。

表3 玉米分離純化代表真菌類(lèi)群Table 3 Representative fungal species separated and purified from corn

2.2 鮮食玉米籽粒生長(zhǎng)期間真菌污染變化

3 個(gè)鮮食玉米品種授粉后不同時(shí)期鮮質(zhì)量鮮食玉米樣品中真菌污染情況見(jiàn)圖4。鮮食玉米在授粉后籽粒發(fā)育期間，以青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）、毛霉（Mucor）、鐮刀菌（Fusarium）、籃狀菌（Talaromyces）為主要污染真菌，其次是交鏈孢（Alternaria）、帚枝霉（Sarocladium）、根霉（Rhizopus）和笄霉（Choanephora），也有少量的橫梗霉（Lichtheimia）、枝孢霉（Cladosporium）、黑孢霉（Nigrospora）和莖點(diǎn)霉（Phoma）的污染。其中0 DAP處于授粉期，均以青霉為主要污染菌；12 DAP和23 DAP污染優(yōu)勢(shì)菌均為青霉、曲霉和毛霉，并出現(xiàn)新類(lèi)型的污染真菌：帚枝霉、枝孢霉和笄霉，污染真菌總量分別是0 DAP的2.5 倍和4 倍；35 DAP和55 DAP污染真菌總量分別是0 DAP的5.7 倍和9.5 倍，優(yōu)勢(shì)菌是青霉、曲霉和鐮刀菌，其次是毛霉、籃狀菌和交鏈孢，并分離出橫梗霉、黑孢霉和莖點(diǎn)霉3 種新類(lèi)型的真菌?？梢?jiàn)，鮮食玉米授粉后籽粒污染真菌在數(shù)量上和種類(lèi)上逐漸增加。

圖4 鮮食玉米授粉后不同時(shí)期真菌污染情況對(duì)比Fig. 4 Comparison of fungal contamination in fresh corn after pollination

根據(jù)不同鮮食玉米品種之間比較，天紫23污染優(yōu)勢(shì)真菌為青霉和曲霉，其次是鐮刀菌和毛霉，共分離出11 個(gè)屬共計(jì)487 株真菌；京科糯2000以青霉和曲霉為主要污染真菌，其次是鐮刀菌和毛霉，共分離出13 個(gè)屬共計(jì)564 株真菌；黑糯6號(hào)污染優(yōu)勢(shì)菌與其他2 個(gè)品種稍有差異，以青霉和毛霉為主，鐮刀菌和曲霉次之，共分離出12 個(gè)屬共計(jì)555 株真菌。經(jīng)對(duì)比，天紫23污染真菌總量和種類(lèi)最少，黑糯6號(hào)次之，京科糯2000污染最重。

2.3 鮮食玉米籽粒生長(zhǎng)期間真菌毒素含量變化

2.3.1 黃曲霉毒素B1含量變化

采用單因素方差分析，對(duì)授粉后不同時(shí)期籽粒中黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行比較（表4），發(fā)現(xiàn)3 個(gè)鮮食玉米品種均在12 DAP黃曲霉毒素B1含量最高，與其他各時(shí)期均差異顯著（P＜0.05），而23 DAP含量最低，其次是0 DAP和35 DAP，三者之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），55 DAP 3 個(gè)品種的黃曲霉毒素B1含量均顯著（P＜0.05）高于0 DAP、23 DAP、35 DAP，但仍顯著（P＜0.05）低于12 DAP。對(duì)品種之間黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行比較，京科糯2000從授粉期0 DAP～55 DAP含量最高，到55 DAP黃曲霉毒素B1含量為（0.244±0.047 3）μg/kg，分別是天紫23和黑糯6號(hào)的1.24 倍和1.23 倍，且差異顯著（P＜0.05），天紫23含量最低為（0.197±0.007 1） μg/kg，但與黑糯6號(hào)（0.198±0.003 7） μg/kg）差異不顯著（P＞0.05）。

表4 鮮食玉米授粉后不同時(shí)期黃曲霉毒素B1含量（以鮮質(zhì)量計(jì)）Table 4 Aflatoxin B1 contents in fresh corn at different days after pollination μg/kg

2.3.2 嘔吐毒素含量變化

如表5所示，比較各時(shí)期之間嘔吐毒素含量變化，發(fā)現(xiàn)授粉后到第12天嘔吐毒素含量最高，之后逐漸下降，23 DAP含量最低，經(jīng)單因素方差分析與35 DAP差異不顯著（P＞0.05），到55 DAP嘔吐毒素含量升高，與23 DAP和35 DAP差異顯著（P＜0.05）。品種之間比較，京科糯2000授粉后前期積累較其他2 個(gè)品種慢，23 DAP開(kāi)始嘔吐毒素高于其他2 個(gè)品種，到55 DAP達(dá)到（80.74±5.89）μg/kg，與天紫23（70.31±4.50）μg/kg和黑糯6號(hào)（61.84±6.58）μg/kg差異顯著（P＜0.05）。

表5 鮮食玉米授粉后不同時(shí)期嘔吐毒素含量Table 5 Deoxynivalenol contents in fresh corn at different days after pollination μg/kg

2.3.3 玉米赤霉烯酮含量變化

對(duì)鮮食玉米授粉后各時(shí)期玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行比較（表6），從授粉期到55 DAP呈先上升、后下降、再上升的趨勢(shì)，玉米赤霉烯酮含量在12 DAP達(dá)到最高峰，與其他各時(shí)期均有顯著差異（P＜0.05）；23 DAP和35 DAP含量最低，2 個(gè)時(shí)期沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；55 DAP玉米赤霉烯酮含量再次達(dá)到高峰，且與其他各時(shí)期均差異顯著（P＜0.05）。根據(jù)品種之間看，23 DAP京科糯2000含量高于黑糯6號(hào)，且兩者之間差異顯著（P＜0.05），除此之外從0 DAP～35 DAP 3 個(gè)品種間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。55 DAP京科糯2000玉米赤霉烯酮含量最高為（4.388±0.075）μg/kg，其次是天紫23為（3.954±0.093）μg/kg，黑糯6號(hào)含量最低為（3.131±0.058）μg/kg，3 個(gè)品種之間差異顯著（P＜0.05）。

表6 鮮食玉米授粉后不同時(shí)期玉米赤霉烯酮含量Table 6 Zearalenone contents in fresh corn at different days after pollination μg/kg

2.4 鮮食玉米主要產(chǎn)毒真菌與毒素積累相關(guān)性分析

對(duì)鮮食玉米主要產(chǎn)毒真菌分別與黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表7所示。Pearson相關(guān)系數(shù)反映了2 個(gè)變量之間的親密度和方向，絕對(duì)值在0～0.1之間表示沒(méi)有相關(guān)性，0.1～0.3之間表示弱相關(guān)，0.3～0.5之間表示中等相關(guān)，大于0.5表示強(qiáng)相關(guān)[16]。由表7可知，產(chǎn)毒真菌數(shù)與相關(guān)真菌毒素含量的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均在0.5以內(nèi)，代表它們是弱相關(guān)或中等相關(guān)，且基本不具備顯著性。由此可以看出鮮食玉米產(chǎn)毒真菌污染數(shù)量與相關(guān)真菌毒素含量不相關(guān)。

表7 主要產(chǎn)毒真菌與真菌毒素含量的相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between major toxic fungi and mycotoxin content

3 討 論

3.1 鮮食玉米生長(zhǎng)發(fā)育期間優(yōu)勢(shì)污染真菌主要為穗腐病相關(guān)菌

3 個(gè)鮮食玉米品種在各時(shí)期污染優(yōu)勢(shì)菌均為青霉屬、毛霉屬、曲霉屬、鐮孢霉屬和籃狀菌屬真菌，占污染真菌總量的71.5%，次要污染真菌為交鏈孢屬、根霉屬、帚枝霉屬、笄霉屬占22.5%，此外還有少量的稀有菌種如莖點(diǎn)霉、黑孢霉、橫梗霉和枝孢霉占6.0%。本實(shí)驗(yàn)分離結(jié)果與張守梅等[17]調(diào)查的山東省部分地區(qū)玉米污染優(yōu)勢(shì)真菌和陳曉琳等[18]從8 個(gè)品種玉米中分離出的污染優(yōu)勢(shì)菌種基本一致，孫華等[19]對(duì)黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)山東、河南和河北三省玉米穗腐病致病真菌分離也獲得了相似的結(jié)果，并表明鮮食玉米生長(zhǎng)期間的這些優(yōu)勢(shì)菌種更容易導(dǎo)致玉米穗腐病[20]，鮮食用途并不會(huì)導(dǎo)致與普通玉米不同的真菌侵染風(fēng)險(xiǎn)。就鮮食應(yīng)用來(lái)講，3 個(gè)品種最佳采收期的污染菌種基本一致，其中天紫23的污染菌株數(shù)量略低于京科糯2000和黑糯6號(hào)（圖4）。

3.2 鮮食玉米乳熟期真菌毒素含量最低，具有比完熟期更好的食品安全保障

本研究以不同鮮食玉米品種的授粉期、灌漿期、乳熟期、蠟熟期和完熟期為調(diào)查節(jié)點(diǎn)，考慮到鮮食玉米和完熟玉米均以其實(shí)際狀態(tài)進(jìn)行食用和應(yīng)用，因此以鮮質(zhì)量為基礎(chǔ)分析污染真菌和毒素積累情況更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)鮮食玉米籽粒發(fā)育過(guò)程中，污染真菌數(shù)量逐漸增加。除了容易引起穗腐病的青霉和毛霉，黃曲霉和鐮刀菌是僅次于青霉和毛霉的主要污染真菌。黃曲霉是黃曲霉毒素B1的產(chǎn)毒菌[21-22]，鐮刀菌是嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的主要產(chǎn)毒菌[23]。在鮮食玉米籽粒整個(gè)發(fā)育期，隨著籽粒發(fā)育，黃曲霉和鐮刀菌的污染真菌數(shù)量逐漸增多，但它們所產(chǎn)生的真菌毒素含量變化有所差異，乳熟期（23 DAP）真菌毒素含量最低，低于蠟熟期（35 DAP）但差異不顯著（P＞0.05），低于灌漿期（12 DAP）和完熟期（55 DAP）且差異顯著（P＜0.05），經(jīng)過(guò)Pearson相關(guān)性分析以鮮質(zhì)量計(jì)的真菌毒素積累與真菌污染無(wú)明顯相關(guān)性（表7）。

出現(xiàn)上述情況的原因，分析可能是真菌毒素的產(chǎn)生受環(huán)境條件的影響，玉米籽粒灌漿初期對(duì)水分需求大，正值夏末秋初氣溫較高，水活度高，適合真菌產(chǎn)毒[24]，加之干物質(zhì)增長(zhǎng)緩慢，真菌毒素的合成加快[25]，導(dǎo)致每千克鮮質(zhì)量籽粒中真菌毒素含量快速升高；而玉米籽粒處于乳熟期時(shí)，干物質(zhì)增長(zhǎng)快速，水分比例降低，毒素積累速率低于干物質(zhì)形成速率，導(dǎo)致每千克鮮質(zhì)量中毒素含量顯著低于灌漿初期（P＜0.05）；玉米籽粒在授粉后第30～36天干物質(zhì)積累達(dá)到最高峰，之后積累速率逐漸降低[26]，到55 DAP，玉米已經(jīng)進(jìn)入完熟期，籽粒干物質(zhì)基本上不再增加[25]，導(dǎo)致每千克鮮質(zhì)量真菌毒素含量升高，且顯著（P＜0.05）高于乳熟期和蠟熟期。GB 2716—2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定食品中黃曲霉毒素B1≤20 μg/kg，嘔吐毒素≤1 000 μg/kg，玉米赤霉烯酮≤60 μg/kg。因此，鮮食玉米授粉后籽粒發(fā)育期間所檢測(cè)真菌毒素均低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。乳熟期采收的鮮食玉米口感優(yōu)良，本研究進(jìn)一步證實(shí)了乳熟期真菌毒素含量最低，因此，對(duì)比我國(guó)傳統(tǒng)的利用完熟玉米籽粒制作食品，發(fā)展鮮食玉米產(chǎn)業(yè)具有更好的食用品質(zhì)和質(zhì)量安全優(yōu)勢(shì)。

3.3 鮮食玉米真菌污染和毒素積累與品種可能有相關(guān)性

本實(shí)驗(yàn)以天紫23、京科糯2000和黑糯6號(hào)3 個(gè)鮮食玉米品種為研究對(duì)象，就鮮食應(yīng)用來(lái)講，3 個(gè)品種最佳采收期的污染菌種基本一致，其中天紫23的污染菌株數(shù)量略低于京科糯2000和黑糯6號(hào)（圖4）。黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮3 種真菌毒素含量在品種間有所差異，京科糯2000表現(xiàn)了顯著（P＜0.05）高于其他2 個(gè)品種的黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和赤霉烯酮含量。分析原因可能是：1）黑糯6號(hào)和天紫232 個(gè)鮮食玉米品種均為彩色，含有豐富的花青素，具有較強(qiáng)的抗氧化活性作用，可以提高玉米籽粒對(duì)致病真菌的抵抗能力[10,27]；有研究也發(fā)現(xiàn)，在玉米生長(zhǎng)發(fā)育初期產(chǎn)生較多的花青素能夠抑制霉菌生長(zhǎng)[28]；2）黑曲霉對(duì)黃曲霉毒素B1具有生物降解作用[29]；李冰等[30]發(fā)現(xiàn)黑曲霉對(duì)黃曲霉毒素B1降解率可達(dá)93.28%，同時(shí)菌體細(xì)胞對(duì)黃曲霉毒素B1也具有一定的吸附作用；孫秀蘭[31]發(fā)現(xiàn)黑曲霉對(duì)黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)69.16%，對(duì)玉米赤霉烯酮的降解率達(dá)86.92%，對(duì)嘔吐毒素的降解率達(dá)48.04%。鮮食玉米23 DAP和35 DAP均有較高的黑曲霉菌株分離出，因此，產(chǎn)毒真菌在產(chǎn)生毒素的同時(shí)，黑曲霉等相關(guān)的毒素降解菌也可能對(duì)毒素起到降解作用。但總體而言，3 個(gè)鮮食玉米品種的黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮含量均遠(yuǎn)低于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高殘留限量。

4 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所測(cè)3 個(gè)鮮食玉米品種天紫23、京科糯2000和黑糯6號(hào)籽粒發(fā)育期間的污染優(yōu)勢(shì)真菌主要為青霉屬、曲霉屬、毛霉屬、鐮孢屬、籃狀菌屬真菌，其次是交鏈孢屬、根霉屬、帚枝霉屬、笄霉屬真菌，還有少量的莖點(diǎn)霉、黑孢霉、橫梗霉和枝孢霉污染。鮮食玉米授粉后第23天乳熟采收期時(shí)黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮的含量最低，屬于玉米食用的最佳時(shí)期。鮮食玉米籽粒發(fā)育期間毒素積累和真菌污染數(shù)量不具相關(guān)性，但可能與品種有關(guān)，測(cè)試品種中黑糯6號(hào)毒素含量最低，其次是天紫23、京科糯2000，3 個(gè)品種鮮食期黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮含量處于安全范圍之內(nèi)，均遠(yuǎn)低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。