油茶籽油甾醇存在形態(tài)及其在精煉和貯藏過程中動(dòng)態(tài)變化分析

賈文聰，方恩華，吳易峰，徐敦明，王曉琴,*

（1.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 油脂及天然產(chǎn)物研究所，福建 廈門 361021；3.廈門海關(guān)技術(shù)中心，福建 廈門 361013）

植物甾醇是一種結(jié)構(gòu)類似環(huán)狀醇的天然活性物質(zhì)，是構(gòu)成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的重要組成成分[1-2]。其來源于植物果實(shí)（種子）油脂以及松科樹木的樹油[3-5]，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、延緩動(dòng)脈粥樣硬化及預(yù)防心腦血管疾病等功能[6-10]。植物甾醇以游離和結(jié)合態(tài)2 種形式存在，其中結(jié)合態(tài)甾醇包括甾醇脂肪酸酯、甾醇酚酸酯、甾基糖苷以及酰化甾基糖苷[11-12]。通過酯化結(jié)合態(tài)甾醇改善其乳化性[13]，可通過減少膽固醇的吸收降低低密度脂蛋白膽固醇（減少7%～10%）[14-15]，降低血液總膽固醇效果比游離甾醇更佳[16]。

植物油作為人類攝取甾醇的主要來源，目前分析工作通常先將油脂進(jìn)行皂化或酸/堿水解，然后再分離檢測，測得游離態(tài)和甾醇酯的含量之和[17-20]，未能區(qū)分游離和結(jié)合態(tài)甾醇。研究者已經(jīng)開始注意到這個(gè)問題，開展了植物油甾醇存在形態(tài)分析，例如，芝麻油、橄欖油、棉籽油中游離甾醇占54%～85%，而菜籽油、玉米油、花生油游離甾醇僅占32%～44%[21]。大豆油中游離甾醇總含量為3 500.20 mg/kg，包括菜籽甾醇、蕓薹甾醇等14 種游離甾醇[22]。蓮子油甾醇主要以結(jié)合態(tài)存在，含量為10.76～11.72 g/100 g[23]。可見，不同植物油甾醇游離和結(jié)合態(tài)分布存在明顯差異，存在形態(tài)分析不可忽略，分析測定不同存在形態(tài)甾醇的組成含量對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)油脂品質(zhì)十分必要。

油茶籽油，又名茶籽油、山茶油，是由山茶屬（CamelliaL.）油茶組（sect.oleifera）和紅山茶組（sect.camellia）植物種子制備而成的油脂[24]。油茶籽油是我國大力發(fā)展的木本食用油，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦的健康食用油[25]。甾醇作為油茶籽油中重要的功能物質(zhì)，已成為國際食品法典委員會(huì)食用植物油標(biāo)準(zhǔn)[26]重要內(nèi)容。油茶籽油甾醇分析工作已有報(bào)道，如檢測到麥角甾醇和香葉基芳樟醇[27]；Δ7-豆甾烯醇和Δ7-燕麥甾烯醇[28]也被檢出，但均未進(jìn)行絕對(duì)定量分析。本課題組已對(duì)油茶籽油11 種甾醇開展了定性定量工作，測得總甾醇含量為4 979.06～6 266.15 mg/kg，主要甾醇化合物包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇等[29]。然而，油茶籽油甾醇分析工作較為有限，存在形態(tài)等進(jìn)一步深入研究工作目前鮮見報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品甾醇存在形態(tài)進(jìn)行分析，并研究精煉工藝和貯藏過程對(duì)油茶籽油不同存在形態(tài)甾醇的影響，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA），揭示油茶籽油甾醇組成及存在形態(tài)特征及其影響因素，旨在為建立油茶籽油甾醇數(shù)據(jù)庫和完善油茶籽油相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為指導(dǎo)生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品為廠家直購；所用毛油為福建寧德地區(qū)采籽低溫壓榨；精煉實(shí)驗(yàn)?zāi)M常規(guī)生產(chǎn)工藝，包括脫酸油、脫水油、脫蠟油、脫臭油；膽甾烷醇（純度＞99%，色譜級(jí)） 北京索萊寶生物科技有限公司；正己烷（色譜級(jí)），正己烷、乙醇、乙醚、氫氧化鉀、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中性氧化鋁柱（1.5 cm×25 cm）、SPE固相萃取柱（500 mg/6 mL Pro Elut Silica） 北京迪馬科技有限公司；BS 2202S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B491恒溫水浴鍋、V70真空泵瑞士BUCHI公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有NIST14S.LIB譜庫） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)合態(tài)甾醇的提取分離

參考ISO 12228∶1999[30]及Xu Baocheng等[31]的方法，并進(jìn)行如下改進(jìn)。取250 mg油樣于50 mL燒瓶中，用25 mL正己烷溶液溶解，加入600 μL膽甾烷醇（1 mg/mL）內(nèi)標(biāo)，混勻備用。稱取1.0 g無水硫酸鈉加到SPE柱的上方，然后用10 mL正己烷溶液活化，流速1.5 mL/min，棄流出液；將前述樣品液注入到SPE柱中，流速1.2 mL/min，棄流出液；再用50 mL正己烷-乙醚（95∶5，V/V）進(jìn)行淋洗，流速控制為1.1 mL/min，收集洗脫液。向洗脫液中加入1 mg/mL膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)溶液600 μL，再加入50 mL濃度為1 mol/L的KOH-CH3CH2OH溶液并混勻。將混合液置于100 ℃水浴下回流皂化50 min；取出并冷卻至室溫后，吸取上述溶液加于活化好的氧化鋁柱中，先用5 mL乙醇淋洗，再用50 mL正己烷溶液洗提，流速2 mL/min，收集洗脫液。將洗脫液旋蒸至干后，用1 mL正己烷（色譜級(jí)）重溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜于樣品瓶中，置于-20 ℃保存待測。

1.3.2 游離態(tài)甾醇的提取分離

參考徐寶成等[22]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。用50 mL正己烷-乙醚（80∶20，V/V）溶液繼續(xù)淋洗1.3.1節(jié)中洗提過結(jié)合態(tài)甾醇的SPE柱，流速控制為1.5 mL/min，收集洗脫液于干燥的燒瓶中。將洗脫液旋蒸至干后，用1 mL正己烷（色譜級(jí)）溶解樣品，過0.22 μm有機(jī)濾膜于樣品瓶中，置于-20 ℃保存待測。

1.3.3 甾醇的定性定量分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行油茶籽油中甾醇類化合物分析測定。

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Rxi-5Sil MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣；載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度300 ℃；檢測器溫度270 ℃；進(jìn)樣口分流比20∶1；進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：柱溫初始溫度180 ℃，然后以14 ℃/min升溫至250 ℃，最后以2 ℃/min升溫至265 ℃，保持22 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電子電離源；接口溫度300 ℃；溶劑延遲5 min；離子源溫度300 ℃；電子能量70 eV；掃描時(shí)間0.5 s；質(zhì)量掃描范圍m/z40～600。

1.3.3.3 定量分析

甾醇化合物的定量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行分析，根據(jù)被測化合物與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積之比計(jì)算組分的含量。計(jì)算公式如下：

式中：Ax為被測組分的色譜峰面積；As為內(nèi)標(biāo)化合物膽甾烷醇的色譜峰面積；ms為內(nèi)標(biāo)化合物膽甾烷醇的質(zhì)量/mg；m為油脂的質(zhì)量/g。

1.3.4 PCA

采用SPSS 25.0對(duì)國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品及精煉、貯藏過程中油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇和游離態(tài)甾醇數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，并繪制PCA載荷圖，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國主要油茶籽油產(chǎn)品不同形態(tài)甾醇分析

2.1.1 結(jié)合態(tài)甾醇分析

如表1、圖1所示，共檢測到9 種結(jié)合態(tài)甾醇，不同油茶籽油產(chǎn)品結(jié)合態(tài)甾醇組分類似，結(jié)合態(tài)甾醇總含量在2 975.46～5 613.15 mg/kg之間，主要包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇等。結(jié)合態(tài)甾醇中，羊毛甾醇含量最高，平均含量為980.91 mg/kg，占總結(jié)合態(tài)甾醇含量的24.4%；海棠果醇含量最低，平均含量為140.54 mg/kg，占總含量的3.5%。

表1 國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品的結(jié)合態(tài)甾醇組成（n=3）Table 1 Bound phytosterol composition of camellia seed oil from major producing areas (n = 3)

圖1 結(jié)合態(tài)甾醇在油茶籽油中的分布Fig. 1 Distribution of bound sterols in camellia seed oil

2.1.2 游離態(tài)甾醇分析

如表2所示，我國主要油茶籽油產(chǎn)品中共檢測到9 種游離態(tài)甾醇，總含量為24.97～100.33 mg/kg。由表2及圖2可知，各游離態(tài)甾醇的相對(duì)占比與其結(jié)合態(tài)不同。游離β-谷甾醇為國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品的共有游離甾醇，且平均含量最高，為17.90 mg/kg，占總游離態(tài)甾醇含量的40.0%；游離態(tài)環(huán)阿屯醇平均含量最低，為0.61 mg/kg，占總游離態(tài)甾醇含量的1.4%。除游離態(tài)β-谷甾醇含量較高外，油茶籽油其他甾醇幾乎均主要以結(jié)合態(tài)形式存在。

圖2 游離態(tài)甾醇在油茶籽油中的分布Fig. 2 Distribution of free sterols in camellia seed oil

表2 國內(nèi)主要油茶籽油產(chǎn)品的游離態(tài)甾醇組成（n=3）Table 2 Free phytosterol composition of camellia seed oil from major producing areas (n = 3)

可見，我國主要油茶籽油產(chǎn)品共檢測到9 種甾醇，均以結(jié)合和游離形態(tài)存在，并以結(jié)合態(tài)為主，總含量為3 072.87～5 713.48 mg/kg，結(jié)合態(tài)甾醇占總含量的97.4%～99.4%，游離態(tài)占0.6%～2.6%，結(jié)合態(tài)甾醇生理活性優(yōu)勢如前言所述，這在一定程度上表明油茶籽油可能具有更好的降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病的作用，與民間生活經(jīng)驗(yàn)相符。

2.2 精煉過程中油茶籽油不同形態(tài)甾醇組成變化分析

2.2.1 結(jié)合態(tài)甾醇

從表3可以看出，油茶籽油毛油在精煉過程中，結(jié)合態(tài)甾醇種類未發(fā)生變化，但含量下降了25.1%。其中，脫酸工藝對(duì)油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇含量影響最大，損失率達(dá)22.0%。在各結(jié)合態(tài)甾醇中，鈍葉醇含量變化最為明顯，下降了59.4%，這可能和其側(cè)鏈雙鍵及位置有關(guān)[32]；β-谷甾醇含量受精煉影響最小，含量下降3.6%。由圖3可知，結(jié)合態(tài)甾醇含量在脫酸過程大幅下降后，在后續(xù)脫水、脫蠟、脫臭工序中，含量變化幅度較小。

圖3 精煉過程中油茶籽油不同形態(tài)甾醇的含量變化Fig. 3 Changes in contents of free and bound sterols in camellia seed oil during refining

2.2.2 游離態(tài)甾醇

由表3可知，油茶籽油游離態(tài)甾醇在精煉過程中含量逐漸降低，下降至72.24 mg/kg，降低了94.1%，尤其在脫酸工序中損失最多，游離態(tài)甾醇含量在此下降了92.9%。游離態(tài)羽扇豆醇含量降低最多，損失率達(dá)99.2%，游離態(tài)(5α,3β,24S)-豆甾-7-烯-3-醇含量變化最小，下降了89.8%，這可能與甾醇自身結(jié)構(gòu)和含量有關(guān)。經(jīng)后續(xù)精煉工序處理后，游離態(tài)甾醇含量下降趨勢減?。▓D3），這與結(jié)合態(tài)甾醇的含量變化趨勢一致。

表3 精煉過程中油茶籽油不同形態(tài)甾醇組成（n=3）Table 3 Free and bound phytosterol compositions of camellia seed oil at different stages of refining (n = 3)mg/kg

可見，在精煉過程中游離態(tài)甾醇較結(jié)合態(tài)甾醇含量損失更大，幾乎全部損耗，尤其是脫酸工藝。脫酸過程向油茶籽油中加入堿和熱水，由于堿與游離脂肪酸中和生成了鈉皂，游離甾醇與皂水會(huì)形成膠團(tuán)并被轉(zhuǎn)移到皂腳中[32]。同時(shí)，鈉皂作為表面活性劑，帶親水性羥基的甾醇可能在此過程中會(huì)被吸附除去[33]，從而使甾醇含量大幅降低。由于甾醇在物理性質(zhì)上主要表現(xiàn)為疏水性[4]，因此脫水對(duì)甾醇的含量影響并不明顯。脫臭過程中，高溫使游離甾醇從中性油中蒸餾出來；但即使在270 ℃和1 Pa條件下，結(jié)合態(tài)甾醇也很難被蒸餾出來[34]。此外，脫蠟、脫臭時(shí)游離甾醇和脂肪酸發(fā)生促酯化反應(yīng)形成結(jié)合態(tài)甾醇，都導(dǎo)致游離甾醇在精煉工藝中含量損失更大。

2.3 貯藏過程中油茶籽油不同形態(tài)甾醇組成變化分析

2.3.1 結(jié)合態(tài)甾醇

如表4所示，油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇含量隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸下降，總含量下降了12.0%。其中，結(jié)合態(tài)海棠果醇含量下降百分比最大，達(dá)28.4%，結(jié)合態(tài)羊毛甾醇含量下降最少，降低了7.8%。從圖4可以看出，整個(gè)貯藏過程中，結(jié)合態(tài)甾醇的含量變化趨勢較為平緩，表明結(jié)合態(tài)甾醇在自然氧化過程中較為穩(wěn)定，這可能與其酯化相連的脂肪酸能抑制甾醇的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減少氧化物羥基甾醇的生成有關(guān)[35]。

表4 貯藏過程中油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇組成（n=3）Table 4 Bound phytosterol composition of camellia seed oil during storage (n = 3)mg/kg

圖4 貯藏過程中油茶籽油不同形態(tài)甾醇的含量變化Fig. 4 Changes in contents of free and bound sterols in camellia seed oil during storage

2.3.2 游離態(tài)甾醇

游離態(tài)甾醇含量在貯藏過程中呈不斷下降趨勢，游離態(tài)甾醇總含量下降了40.9%（表5）。游離態(tài)羽扇豆醇含量下降最大，降低了46.4%；游離態(tài)β-谷甾醇含量變化最小，為35.1%，可能與其側(cè)鏈長度和結(jié)構(gòu)中雙鍵個(gè)數(shù)有關(guān)[36]。由圖4可知，游離甾醇含量變化較大，下降幅度大于結(jié)合態(tài)甾醇。在貯藏期間，游離態(tài)甾醇含量下降速率呈現(xiàn)變化，這可能是溫度和光照強(qiáng)度變化導(dǎo)致游離甾醇氧化速率不同。

表5 貯藏過程中油茶籽油游離態(tài)甾醇組成（n=3）Table 5 Free phytosterol composition of camellia seed oil during storage (n = 3)mg/kg

在貯藏過程中，油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇含量下降了12.0%，相對(duì)于游離態(tài)甾醇的含量損失（40.9%），結(jié)合態(tài)甾醇表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。結(jié)合態(tài)甾醇比游離態(tài)甾醇更加穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榻Y(jié)合態(tài)甾醇連接了與其酯化的不飽和脂肪酸。在自然氧化初期，這些不飽和脂肪酸會(huì)先于甾醇劣變，其不飽和鍵對(duì)甾醇氧化的C5、C6環(huán)氧路徑和C7羥/酮路徑產(chǎn)生抑制作用，從而延緩甾醇氧化[36]。因此，在貯藏過程中結(jié)合態(tài)甾醇比游離態(tài)氧化緩慢，具有更強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[37-38]。

2.4 油茶籽油不同形態(tài)甾醇PCA

在對(duì)我國主要油茶籽油產(chǎn)品、精煉過程中油茶籽油以及貯藏過程中的油茶籽油結(jié)合態(tài)和游離態(tài)甾醇進(jìn)行測定后，以各甾醇為原始變量，應(yīng)用PCA法對(duì)油茶籽油甾醇主體化合物進(jìn)行可視化表征，結(jié)果如圖5所示。

圖5 油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇（a）與游離態(tài)甾醇（b）PCA荷載圖Fig. 5 PCA loading plots of bound sterols (a) and free sterols (b) in camellia seed oil

2.4.1 結(jié)合態(tài)甾醇PCA

PCA法常采用方差累計(jì)貢獻(xiàn)率確定PC數(shù)目。結(jié)合態(tài)甾醇特征值大于1的PC數(shù)量為2，PC1的特征值為5.84，方差貢獻(xiàn)率為64.9%，PC2的特征值為1.28，方差貢獻(xiàn)率為14.2%，前2 個(gè)PC累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為79.1%，即2 個(gè)PC解釋了總變異的79.1%，可提取前2 個(gè)PC。

選取前2 個(gè)PC繪制PCA荷載圖（圖5a），可以看出，羊毛甾醇和環(huán)阿屯醇在PC1上得分較高，羽扇豆醇在PC2上得分較高，總方差70.0%以上的貢獻(xiàn)來自PC1、PC2，可見，結(jié)合態(tài)羊毛甾醇、結(jié)合態(tài)環(huán)阿屯醇和結(jié)合態(tài)羽扇豆醇對(duì)油茶籽油結(jié)合態(tài)甾醇組成影響較大，是油茶籽油中表現(xiàn)穩(wěn)定的特征甾醇，這與其在不同來源、精煉和貯藏過程中的變異分析結(jié)果相符（表1、3、4），其中結(jié)合態(tài)羊毛甾醇是油茶籽油最穩(wěn)定存在的結(jié)合態(tài)甾醇化合物。

2.4.2 游離態(tài)甾醇PCA

在PCA中，游離態(tài)甾醇特征值大于1的PC有2 個(gè)，PC1的特征值為4.29，方差貢獻(xiàn)率為47.6%，PC2的特征值為3.52，方差貢獻(xiàn)率為39.1%，前2 個(gè)PC累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.7%，即2 個(gè)PC解釋了總變異的86.7%，故提取前2 個(gè)PC進(jìn)行分析。

將PCA荷載矩陣進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，如圖5b所示，PC1與β-谷甾醇、鈍葉醇、(5α,3β,24S)-豆甾-7-烯-3-醇高度負(fù)相關(guān)，PC2與樺木醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇高度正相關(guān)，每個(gè)PC都有與其高度相關(guān)的甾醇化合物，這表明該P(yáng)C基本可以反映與其高度相關(guān)甾醇的信息。β-谷甾醇在PC1上得分較高，樺木醇在PC2上得分較高，故游離態(tài)β-谷甾醇和樺木醇對(duì)油茶籽油游離態(tài)甾醇組成影響較大，是油茶籽油特征游離態(tài)甾醇，這也在油茶籽油甾醇組成分析結(jié)果中得到驗(yàn)證（表2），同時(shí)游離態(tài)β-谷甾醇在精煉和貯藏中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性（表3、5），是油茶籽油中最穩(wěn)定存在的游離態(tài)甾醇。

結(jié)合態(tài)羊毛甾醇和游離態(tài)β-谷甾醇分別在不同形態(tài)甾醇荷載圖主因子上得分最高，對(duì)油茶籽油甾醇組成影響最大，是油茶籽油主體甾醇化合物，在油茶籽油不同產(chǎn)品、精煉過程以及貯藏過程中都穩(wěn)定存在。值得注意的是，游離態(tài)甾醇的最穩(wěn)定物質(zhì)與結(jié)合態(tài)不一致，這印證了在油茶籽油成品油、精煉油和貯藏油中，不同形態(tài)甾醇中均存在穩(wěn)定的主體物質(zhì)，甾醇存在形態(tài)不能被忽略。

3 結(jié) 論

我國油茶籽油產(chǎn)品甾醇共檢測到9 種，均以結(jié)合和游離形態(tài)存在，總含量為3 072.87～5 713.48 mg/kg，主要甾醇化合物包括羊毛甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇、β-谷甾醇。結(jié)合態(tài)甾醇占97.4%～99.4%，是油茶籽油甾醇的主要存在形式，可以反映油茶籽油甾醇的總體特征，這也表明傳統(tǒng)皂化方法分析預(yù)處理的可行性。油茶籽油精煉后，游離態(tài)甾醇受影響較大，含量降低了94.1%；結(jié)合態(tài)含量變化較小，下降了25.1%。其中脫酸對(duì)2 種形態(tài)甾醇的影響均最大，游離和結(jié)合態(tài)甾醇含量在此分別損失了92.9%、22.0%。在12 個(gè)月貯藏過程中，結(jié)合態(tài)和游離態(tài)甾醇含量分別下降了12.0%和40.9%，結(jié)合態(tài)甾醇比游離態(tài)表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化穩(wěn)定性。PCA及荷載分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)合態(tài)羊毛甾醇和游離態(tài)β-谷甾醇是油茶籽油最主要特征甾醇，在油茶籽油不同產(chǎn)品、精煉和貯藏中都穩(wěn)定存在?？梢?，油茶籽油游離態(tài)和結(jié)合態(tài)甾醇在精煉、貯藏中表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充了油茶籽油甾醇存在形態(tài)數(shù)據(jù)，并研究了來源、精煉和貯藏等因素的影響，為油茶籽油甾醇研究和開發(fā)提供了基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，同時(shí)也打開了油茶籽油甾醇氧化研究的新視角。