白術(shù)芍藥散作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

陸麗娟，史 敏（通訊作者）

（1蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥劑科 江蘇 蘇州 215003）

（2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院<蘇州市吳門醫(yī)派研究院中藥臨床藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室> 江蘇 蘇州 215009）

白術(shù)芍藥散由白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)4味藥組成，因其治療腹痛泄瀉效果較好又得名“痛瀉要方”，具有補(bǔ)脾柔肝，調(diào)和氣機(jī)，祛濕止瀉之功效[1]。臨床常用來(lái)治療各種原因?qū)е碌母篂a、腸炎等消化系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)白術(shù)芍藥散有鎮(zhèn)痛、抗炎、止瀉、抗腫瘤等作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從中藥多成分、多靶標(biāo)、多途徑方面闡釋藥物作用機(jī)制，有助于在系統(tǒng)層次和分子水平揭示藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理[2]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)白術(shù)芍藥散藥物作用機(jī)制進(jìn)行分析。

1.方法

1.1 篩選化學(xué)成分并預(yù)測(cè)靶蛋白

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP Version: 2.3，分別以“白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)”為關(guān)鍵詞，得到化合物白術(shù)55種，白芍85種，陳皮63種，防風(fēng)173種。以生物利用度（OB）和類藥性（DL）為篩選閾值得到候選化合物?；赥CMSP服務(wù)器預(yù)測(cè)其潛在靶點(diǎn)，同時(shí)使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相關(guān)靶點(diǎn)蛋白信息。

1.2 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步分析靶點(diǎn)蛋白在整體水平上的作用，將1.1中得到的120個(gè)基因上傳至STRING11.0（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)。物種設(shè)為“人”，最低相互作用選擇confidence≥0.7，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。將互作關(guān)系數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件，利用Cytohubba插件獲得度值前5的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白作進(jìn)一步分析，靶點(diǎn)的度值表示相互作用的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)。

1.3 GO-BP和KEGG通路富集分析

本研究采用David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO-BP富集分析和KEGG通路富集分析。以“P＜0.01，基因數(shù)大于13”作為篩選條件，得到白術(shù)芍藥散靶點(diǎn)主要的生物功能及可能性較大的信號(hào)通路，并且利用R軟件對(duì)GO-BP富集分析中的GO條目和KEGG通路繪制氣泡圖。

2.結(jié)果

2.1 獲取候選化合物及靶點(diǎn)

根據(jù)1.1篩選條件共得到的40種化合物。其中MOL000358為防風(fēng)、白芍共有成分，MOL000359為防風(fēng)、陳皮、白芍共有成分。通過(guò)TCMSP服務(wù)器預(yù)測(cè)靶點(diǎn)可獲得33種化合物與其匹配的120個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

2.2 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖中每條邊表示方藥與化合物、化合物與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。節(jié)點(diǎn)的度（Degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)，隨著度值增大，節(jié)點(diǎn)的形狀變大。構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖A，化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖共包括153個(gè)節(jié)點(diǎn)（33種化合物、120個(gè)靶點(diǎn)）和489條邊。白術(shù)中度值較高的化合物為MOL000049（3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮，度=21），MOL000072（8β-乙氧基蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，度=13），白芍中度值較高的化合物為MOL000422（山奈酚，度=56）、MOL000358（β-谷甾醇，度=53）；防風(fēng)中度值較高的化合物為MOL000173（漢黃芩素，度=37）；此外陳皮中的MOL004328（柚皮素，度=38），MOL005828（川陳皮素，度=35）。由此可以推測(cè)出這些度值高的化合物可能是白術(shù)芍藥散中的核心藥效物質(zhì)。另外在120個(gè)靶點(diǎn)中，有61個(gè)靶點(diǎn)與1個(gè)活性成分連接，有59個(gè)靶點(diǎn)與2個(gè)以上活性成分連接。33種活性成分都至少與2個(gè)作用靶點(diǎn)相連接，提示白術(shù)芍藥散作用于生物網(wǎng)絡(luò)具有多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜性。

將120個(gè)靶蛋白對(duì)應(yīng)的基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲取PPI網(wǎng)絡(luò)并將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件中，得到120個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 305條邊，見圖B。用cytohubba插件基于degree算法篩選出得分前5的蛋白作為Hub蛋白。這5個(gè)Hub蛋白分別為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1），白介素-6（interleukin-6，IL6），絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3），腫瘤抑制因子p53（tumor protein p53，TP53），轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（transcription factor AP-1，JUN），分別聯(lián)系72、65、62、60、55個(gè)蛋白。

圖1 白術(shù)芍藥散靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖、生物過(guò)程及通路分析氣泡圖

2.3 GO-BP生物過(guò)程和KEGG信號(hào)通路富集分析

本研究從GO-BP富集分析定位白術(shù)芍藥散靶點(diǎn)蛋白最主要的生物學(xué)過(guò)程。GO-BP富集分析獲得428個(gè)條目，下載DAVID BP富集結(jié)果，分析PValue值。具有顯著意義的（P＜0.01）條目有176條（PValue＜0.0095），從中篩選基因數(shù)目大于13個(gè)基因的條目，共得到11條富集條目見圖C。參與對(duì)藥物的應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、增殖凋亡、衰老和氧化還原等生物過(guò)程。KEGG通路富集分析共獲得127條通路，下載DAVID KEGG富集結(jié)果，分析PValue值具有顯著意義（P＜0.01）的有91條，其中基因數(shù)目大于13的通路共18條（PValue＜0.0021）見圖D。涉及結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、PI3K-AKT以及cAMP、TNF、肺結(jié)核、肝炎等信號(hào)通路。通路上的所含的靶點(diǎn)基因越多，白術(shù)芍藥散越有可能通過(guò)這些通路發(fā)揮作用。

3.討論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法通過(guò)構(gòu)建化學(xué)成分、靶點(diǎn)、疾病網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)靶點(diǎn)的生物功能及通路進(jìn)行富集分析。方藥中化合物3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮、8β-乙氧基蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、漢黃芩素、川陳皮素能匹配到較多靶點(diǎn)，可能是方藥發(fā)揮藥效的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。

由PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、MAPK3、TP53、JUN等是白術(shù)芍藥散的主要靶點(diǎn)蛋白。AKT1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、增殖凋亡及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)靶向AKT1抑制腎癌癌細(xì)胞的增殖和遷移[3]。IL6是一種細(xì)胞炎性因子，參與細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。馬智聰發(fā)現(xiàn)IL-6在克羅恩病患者腸黏膜組織的炎性反應(yīng)損傷過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[4]。王凱等人發(fā)現(xiàn)加味白術(shù)芍藥散可以降低潰瘍性結(jié)腸炎患者IL-6、TNF等炎性因子的水平，同時(shí)可以改善患者的免疫功能[5]。TP53是一種抑癌基因，其突變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展中的功能作用已被廣泛研究。結(jié)直腸癌是一種實(shí)體瘤，該基因突變是其推動(dòng)腺瘤向腺癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟，同時(shí)與不良預(yù)后和化療耐藥相關(guān)[6]。JUN作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，對(duì)細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活與細(xì)胞凋亡等重要生理過(guò)程具有調(diào)控作用。NO的釋放是由NOS3所調(diào)控，NOS3基因多態(tài)性與肺動(dòng)脈高壓有關(guān)[7]。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白為白術(shù)芍藥散治療相關(guān)疾病提供依據(jù)。

通過(guò)對(duì)靶基因的富集分析發(fā)現(xiàn)，白術(shù)芍藥散涉及多種生物過(guò)程及信號(hào)通路與多種腫瘤疾病相關(guān)，如口腔癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。除山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素具有抗腫瘤作用外，漢黃芩素通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT、MAPKs等多條信號(hào)通路作用于腫瘤細(xì)胞生成的各個(gè)過(guò)程[8-9]。川陳皮素通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲、及調(diào)節(jié)癌細(xì)胞周期和蛋白表達(dá)多個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等也具有極強(qiáng)的抗腫瘤活性[10]。因此方藥中的有效成分可能通過(guò)腫瘤信號(hào)通路上的TP53、AKT1、CASP3及ESR1等靶點(diǎn)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤的作用，但目前白術(shù)芍藥散治療腫瘤性疾病臨床應(yīng)用報(bào)道極少。因此，白術(shù)芍藥散抗腫瘤可以作為未來(lái)研究方向有待進(jìn)一步驗(yàn)證。