一種Zalerion arboricola發(fā)酵產(chǎn)物的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定

張 磊， 呂堅(jiān)方， 邵 東， 徐作武， 王小平 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 新昌 312500

自從第一個(gè)抗真菌藥兩性霉素B問世以來(lái)，人類與真菌感染類疾病的斗爭(zhēng)已經(jīng)持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì)。按照國(guó)際醫(yī)學(xué)界的通行標(biāo)準(zhǔn)，真菌感染可分為淺表性真菌感染、皮下真菌感染和系統(tǒng)性真菌感染。其中系統(tǒng)性真菌感染(即深部真菌感染)最具致命性。在預(yù)防和治療淺表性真菌感染方面，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)已取得突破。但對(duì)于皮下及深部真菌感染，因真菌抗藥性及現(xiàn)有藥物的毒副作用等原因，尚未取得顯著進(jìn)展。近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑和抗惡性腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，開放性治療手段如器官移植、插管技術(shù)及外科介入治療的深入開展，增加了深部真菌感染的發(fā)病機(jī)率。條件致病性真菌所引發(fā)的系統(tǒng)性真菌病日益增多，如患者不能獲得及時(shí)治療，往往會(huì)病情加重甚至危機(jī)生命。[1]

臨床上治療真菌感染使用的藥物主要有兩性霉素B和唑類抗真菌藥物(如氟康唑、伊曲康唑和伏力康唑等)，但這些藥物在安全性和抗菌譜等方面均存在一些問題，因此臨床上亟待開發(fā)高效、低毒的新型廣譜抗真菌藥物。在大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究人員找到了對(duì)治療真菌感染有顯著療效的棘白菌素類化合物。該類化合物可抑制真菌細(xì)胞壁的β-1,3-D-葡聚糖的合成，破壞細(xì)胞壁完整性，從而發(fā)揮殺菌作用。因哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，故該類化合物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞并無(wú)影響。進(jìn)一步臨床研究表明，該類化合物與兩性霉素B和唑類抗真菌藥物無(wú)交叉耐藥性，對(duì)人體的毒性低，臨床效果較好。其中以芬凈類化合物為代表已上市多年[2]。

卡泊芬凈是以微生物發(fā)酵產(chǎn)物紐莫康定B0為中間體經(jīng)化學(xué)合成而得。在更廣泛的相似類化合物篩選過(guò)程中，研究人員又發(fā)現(xiàn)該類化合物的其他多種類似物。這些類似物均以乙酰六環(huán)為基本結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)合不同取代基，從而導(dǎo)致分子的抗真菌活性及代謝性質(zhì)等方面表現(xiàn)出一定程度的差異[3]。

在從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中篩選具有抗真菌活性化合物的過(guò)程中，除了對(duì)菌體的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究外，還應(yīng)對(duì)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的其他多種化合物進(jìn)行考察。在從菌體代謝產(chǎn)物中成功分離得到單一化合物后，再對(duì)這些化合物進(jìn)行抗菌活性考察。也可以對(duì)所獲得的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，然后再進(jìn)行抗菌活性的篩選。這樣就有可能篩選得到藥效更好、不良反應(yīng)更少的新活性化合物[4]。Zalerionarboricola菌體在發(fā)酵過(guò)程中除通過(guò)次級(jí)代謝可以產(chǎn)生紐莫康定B0之外，也會(huì)產(chǎn)生多種其他的結(jié)構(gòu)類似物[5]。目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中在紐莫康定B0發(fā)酵工藝優(yōu)化以及發(fā)酵液中紐莫康定B0的提取純化[6-9]，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的其他結(jié)構(gòu)類似物的分離純化則鮮有報(bào)道。本文從Zalerionarboricola發(fā)酵液中分離到一個(gè)紐莫康定B0的結(jié)構(gòu)類似物并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。以該化合物為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，就可以進(jìn)一步確定修飾物的抗真菌效果[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

ZalerionarboricolaHCCB30111保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.5412。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基PDA(%)：葡萄糖 25，蛋白胨 0.9，瓊脂 2.0。

種子培養(yǎng)基(%)：葡萄糖 2.5，KH2PO40.9，酵母粉 0.5，泡敵 1.0，85%乳酸 0.2 mL，微量元素 0.1 mL，pH 6.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：蔗糖 12.5，谷氨酸鈉 0.8，酵母粉 0.8，脯氨酸 1.5，KH2PO40.15，七水合硫酸鎂 0.04，泡敵 1.0，微量元素 1 mL，MES緩沖鹽 1.5，pH 5.3；

微量元素組成(g/L)：七水硫酸亞鐵 1.0，一水硫酸錳 0.2，二水氯化鈣 0.1，硼酸 0.056，二水氯化銅 0.025，四水鉬酸銨 0.019，12N鹽酸 50 mL。

1.1.3主要儀器

制備型液相色譜儀DAC 50(江蘇漢邦科技有限公司)，1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，6520 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)，核磁共振波譜儀DMX400(德國(guó)布魯克公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀YRE-201D(鞏義予華儀器公司，中國(guó))，實(shí)驗(yàn)型凍干機(jī)FD-80(北京博醫(yī)康科技有限公司)。X3色譜填料(10 μm,大連化學(xué)物理研究所)；C18色譜填料(10 μm，蘇州納微科技有限公司)。XAD-1180N大孔吸附樹脂(陶氏化學(xué)公司，美國(guó))。

1.1.4試劑

乙醇(分析純)購(gòu)自安徽安特食品股份有限公司。丙酮(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。乙腈(分析純)購(gòu)自星可化學(xué)科技(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)條件

色譜柱：Phenomenex kinetex C18 (2.6 μm,1.7 mm×150 mm)；流動(dòng)相：乙腈∶水=40∶60；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：35 ℃。

1.2.2質(zhì)譜檢測(cè)條件

直接進(jìn)樣模式，電噴霧電離源(ESI)正離子檢測(cè)，裂解電壓135 V，離子源溫度230 ℃，氣體流速：8.0 L/min,樣品濃度1 mg/mL。

1.2.3核磁共振檢測(cè)條件

測(cè)試條件為CD3OD；觀察頻率100 MHz，掃描范圍-20 ppm～220 ppm。采樣時(shí)間0.68 s，延遲時(shí)間2 s，掃描次數(shù)5 120次，測(cè)定溫度300 K。

1.2.4紐莫康定B0(Pneumocandin B0)發(fā)酵液的制備

斜面培養(yǎng)條件：28 ℃，5 d；種子培養(yǎng)條件：挖塊接種，25 ℃，220 r/min ，3 d；發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)種量10%，25 ℃，220 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)7 d。

1.2.5固液分離及粗品的制備

紐莫康定B0發(fā)酵液為實(shí)驗(yàn)室自制[11]。發(fā)酵液30 L用陶瓷膜過(guò)濾濃縮至15 L；第一次萃取在濃縮液中加入15 L乙醇，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過(guò)濾至約10 L；第二次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過(guò)濾至約10 L；第三次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循環(huán)罐循環(huán)30 min后用陶瓷膜過(guò)濾至約10 L結(jié)束操作。每次萃取濾液都用大孔吸附樹脂(樹脂柱體積200 mL)吸附萃取液中目標(biāo)產(chǎn)物。

吸附后的樹脂柱用40%乙醇預(yù)洗，洗下色素類雜質(zhì)及其它吸附不牢的雜質(zhì)；再用70%乙醇解析，分段收集解析液。利用液相檢測(cè)后，合并含高濃度目標(biāo)產(chǎn)物的解析液，然后加入1倍體積的活性炭脫色。過(guò)濾除去活性炭后，脫色液45 ℃減壓濃縮除乙醇，得到含有目標(biāo)組份的固液混合物，凍干后得到粗品。

1.2.6目標(biāo)化合物的富集

目標(biāo)化合物的富集使用DAC 50制備柱(裝入X3色譜填料約500 mL)進(jìn)行。粗品溶解于85%丙酮-水溶液中(濃度為每毫升液體溶解0.1 g粗品)，制備時(shí)每次進(jìn)樣體積 50 mL，流動(dòng)相為丙酮∶水=85∶15，進(jìn)樣后可以根據(jù)在線圖譜監(jiān)測(cè)組份層析情況，目標(biāo)組分出現(xiàn)色譜吸收峰后分段收集，收集完成后結(jié)束本次制備分離，進(jìn)行第二次制備，重復(fù)進(jìn)樣-分段收集操作，直至積累足夠的樣品。每次制備的分段收集液用HPLC檢測(cè)，合并純度≥75%的部分作為有效層析液，45 ℃減壓濃縮除丙酮后進(jìn)入下一步。

1.2.7純化

使用裝C18色譜填料(約500 mL)的DAC 50制備柱進(jìn)行純化。上一步得到的料液，按照體積加入60%的乙腈，全部溶解后作為本步料液。制備時(shí)每次進(jìn)樣體積25 mL，流動(dòng)相為乙腈∶水=65∶35，進(jìn)樣后可以根據(jù)在線圖譜監(jiān)測(cè)組份層析情況，目標(biāo)組分出現(xiàn)色譜吸收峰后分段收集，收集完成后結(jié)束本次制備分離，進(jìn)行第二次制備，重復(fù)進(jìn)樣-分段收集的的操作，直至積累足夠的樣品。每次制備的分段收集液用HPLC檢測(cè)，合并純度≥95%的部分作為有效層析液，45 ℃減壓濃縮除乙腈后，進(jìn)行后處理。

1.2.8后處理

純化后的合格收集液，45 ℃減壓濃縮除去乙腈后進(jìn)行凍干，得到目標(biāo)化合物樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，條件為電離源(ESI)正離子模式。對(duì)目標(biāo)化合物的主要信號(hào)峰進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1和表1所示。目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為1 065.580 9，元素組成為C50H81N8O17；1 047.566 7峰為目標(biāo)化合物脫去OH基團(tuán)的信號(hào)峰；1 065.581 2、1 067.566 4為目標(biāo)化合物準(zhǔn)分子離子的同位素信號(hào)峰。

圖1 目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜圖

表1 目標(biāo)化合物的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)

2.2 目標(biāo)化合物的核磁共振譜數(shù)據(jù)

對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行核磁共振檢測(cè)，測(cè)試條件為CD3OD。所得核磁檢測(cè)譜圖包括：圖2(目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)1H譜)；圖3(目標(biāo)化合物的核磁共振檢測(cè)13C譜)；圖4(目標(biāo)化合物的核磁共振檢測(cè)COSY譜)；圖5(目標(biāo)化合物的核磁共振檢測(cè)HMBC譜)；目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)匯總見表2。

2.3 目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)解析

按照樣品的結(jié)構(gòu)，殘基可分為3-OHPro、OHGln、DiOHTyr、4-OHPro、Thr、DiOHPro和DMM七個(gè)部分。對(duì)核磁相關(guān)譜圖(圖2和圖3)進(jìn)行分析表明：該化合物有4個(gè)甲基、16個(gè)亞甲基(其中2個(gè)連N原子，分別為3-OHPro 中的C-5和4-OHPro中的C-5)、 16個(gè)是次甲基(7個(gè)氧代，6個(gè)氮代，1個(gè)氧氮二元代)、 1個(gè)二取代的苯環(huán)、8個(gè)羰基碳。1H、13C-NMR數(shù)據(jù)(表1)和二維相關(guān)光譜表明該化合物是一個(gè)pneumocandin A0類似物，具有2個(gè)羥基脯氨酸(3-OHPro和4-OHPro)、1個(gè)二羥基酪氨酸類似物(DiOHTyr)、1個(gè)羥基谷氨酰胺(OHGln)、1個(gè)蘇氨酸(Thr)、一個(gè)二羥基脯氨酸(DiOHPro)和1個(gè)二甲基肉豆蔻酸。通過(guò)COSY和HMBC相關(guān)譜(圖4和圖5)，連接得到了該化合物的平面結(jié)構(gòu)。

表2 目標(biāo)化合物的核磁共振檢測(cè)1H和13C-NMR數(shù)據(jù)匯總

圖2 目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)1H譜圖

圖3 目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)13C譜圖

COSY譜(圖4)顯示化合物有下列5個(gè)自旋偶合相關(guān)體系：3-OHPro: 2-CH→3-CH→4-CH2→5-CH2；OHGln: 2-CH→3-CH→4-CH2；DiOHTyr: 2-CH→3-CH→4-CH和2’/6’-CH→3’/5’-CH；4-OHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH2；Thr: 2-CH→3-CH→4-CH3；DiOHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH；DMM: 2-CH2→3-CH2→4-CH2→5-CH2→6-CH2→7-CH2→8-CH2→9-CH2→10-CH→11-CH2→12-CH→13-CH2→14-CH3?！緜渥ⅲ捍硕谓M織成合適的閱讀結(jié)構(gòu)】

圖4 目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)COSY譜圖

1H-13C-NMR遠(yuǎn)程偶合相關(guān)譜(圖5)表明：3-OHPro中2-H和5-H2與OHGln中的1-C相關(guān)，表明OHGln通過(guò)酰胺鍵與3-OHPro相連；OHGln中2-H與DiOHTyr中的1-C相關(guān)，表明DiOHTyr通過(guò)酰胺鍵與OHGln相連；DiOHTyr中2-H與4-OHPro中的1-C相關(guān)，表明4-OHPro通過(guò)酰胺鍵與DiOHTyr相連；4-OHPro中2-H和5-H2與Thr中的1-C相關(guān)，表明Thr通過(guò)酰胺鍵與4-OHPro相連；Thr中2-H與DiOHPro中的1-C相關(guān)，表明DiOHPro通過(guò)酰胺鍵與Thr相連；DiOHPro中2-H與DMM中的1-C相關(guān)，表明DMM通過(guò)酰胺鍵與DiOHPro相連。

圖5 目標(biāo)化合物核磁共振檢測(cè)HMBC譜圖

通過(guò)COSY和HMBC的二維相關(guān)，把各基團(tuán)相連，得到化合物的完整結(jié)構(gòu)，如圖6所示：

圖6 紐莫康定6b的分子結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

本文以Zalerionarboricola菌體發(fā)酵液為原料，依次通過(guò)陶瓷膜固液分離，大孔樹脂吸附目標(biāo)產(chǎn)物，解析后活性炭脫色，減壓濃縮除去溶劑后凍干得到粗品。粗品溶解后，用X3色譜填料進(jìn)行目標(biāo)化合物的層析富集，含量合格的層析液進(jìn)行減壓濃縮，得到富集后的目標(biāo)化合物樣品。再次溶解后，用C18色譜填料進(jìn)行目標(biāo)化合物的層析純化，含量合格的層析液進(jìn)行減壓濃縮，凍干后得到目標(biāo)化合物樣品。最后通過(guò)高分辨質(zhì)譜、核磁共振檢測(cè)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)對(duì)鑒定時(shí)得到的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析匯總，并和文獻(xiàn)報(bào)道的1H和13C-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，兩者信息一致；再通過(guò)COSY和HMBC的二維相關(guān)，把各基團(tuán)相連，得到化合物的完整結(jié)構(gòu)，也和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)一致，可以確認(rèn)該化合物為紐莫康定6b。[12]

制備得到目標(biāo)化合物后，有多方面的實(shí)際意義。首先，以該化合物的含量作為一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)，可以優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，控制發(fā)酵產(chǎn)物中紐莫康定6b的比例，從而降低隨后的純化工藝的難度，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持；其次，在紐莫康定6b的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行化學(xué)合成，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，連接不同取代基團(tuán)后在進(jìn)行生物活性的篩選，有可能得到潛在的抗菌活性更好的化合物。