1例危重癥新型冠狀病毒肺炎合并感染馬爾尼菲籃狀菌的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種直徑為60～140 nm的β屬冠狀病毒，病毒顆粒有包膜，呈圓形、橢圓形，以呼吸道飛沫、密切接觸和氣溶膠為主要傳播途徑[1-2]。由其引起的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、乏力等呼吸道感染癥狀，嚴(yán)重時(shí)可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征。馬爾尼菲籃狀菌屬于青霉菌屬，易感于免疫功能缺陷或免疫功能抑制的患者，多發(fā)于艾滋病患者,并發(fā)于其他疾病較少，馬爾尼菲籃狀菌感染后其臨床表現(xiàn)與COVID-19大致相同且起病隱匿，誤診率高，病死率高[3-4]。本文就2020年2月本院收治的1例危重癥COVID-19患者合并感染馬爾尼菲籃狀菌的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析并報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料 2020年2月本院收治的1例危重癥COVID-19并發(fā)馬爾尼菲籃狀菌感染患者的標(biāo)本，COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)符合華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)制訂的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第五版)》[5]中相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。病例資料：患者，男，72歲，于2020年2月10日因CT檢查兩肺炎癥，SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性，確診COVID-19收治于本院，無(wú)基礎(chǔ)疾病史，于2月21日病情加重上人工體外膜肺氧合機(jī)(EMCO)；2月29日并發(fā)嗜麥芽窄食單胞菌感染，3月12日并發(fā)假絲酵母菌感染，5月2日血液檢出馬爾尼菲籃狀菌，期間使用的抗菌藥物包括頭孢曲松/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、替考拉林、萬(wàn)古霉素、多黏菌素、卡泊芬凈、米泊芬凈等，自5月6日改用兩性霉素B和伏立康唑治療。

1.2方法

1.2.1微生物標(biāo)本檢驗(yàn) 血液、膽汁、腹水、胸腔積液抽取標(biāo)本10 mL注入法國(guó)梅里埃血培養(yǎng)瓶；導(dǎo)管尖端、傷口分泌物、中段尿、痰液、肺泡灌洗液，置于無(wú)菌容器中，3層包裝并置于貼有生物安全標(biāo)志箱子立即送檢。生物安全柜中，打開(kāi)包裝對(duì)無(wú)菌容器進(jìn)行75%乙醇消毒。痰標(biāo)本挑取黏稠標(biāo)本進(jìn)行涂片檢查，紫外線照射滅活病毒30 min，置于染片盒里進(jìn)行革蘭染色法初染后，后拿出生物安全柜進(jìn)行后續(xù)染色。經(jīng)革蘭染色后若上皮細(xì)胞<10個(gè)/低倍視野、白細(xì)胞>25個(gè)/低倍視野為合格標(biāo)本。

血液、膽汁、腹水、胸腔積液標(biāo)本使用法國(guó)梅里埃血培養(yǎng)儀報(bào)陽(yáng)轉(zhuǎn)種血平板、麥康凱平板、沙保羅平板，其他標(biāo)本直接接種沙保羅平板；血平板、麥康凱平板放于37 ℃孵育箱培養(yǎng)，沙保羅平板放于37 ℃和28 ℃孵育箱，經(jīng)4～5 d培養(yǎng)分離后挑選可疑菌落，進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.2.1.1血清曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)檢測(cè) 一次性真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，采用酶聯(lián)免疫夾心法，使用特異性抗體檢測(cè)GM，待測(cè)樣本指數(shù)(I)=待測(cè)樣本吸光度(A)值/臨界值質(zhì)控A值，結(jié)果判斷I≥0.50為陽(yáng)性，I<0.50為陰性。使用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，接受清蛋白等血液制品治療及其他真菌感染(如青霉菌)有交叉反應(yīng)，若有預(yù)防霉菌治療則出現(xiàn)假陰性。

1.2.1.2真菌(1-3)-β-D葡聚糖檢測(cè) 專用一次性無(wú)熱源真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，2 h內(nèi)檢測(cè)。真菌(1-3)-β-D葡聚糖特異性激活G因子，進(jìn)而激活凝固酶原，凝固酶水解反應(yīng)引起A值變化從而定量真菌(1-3)-β-D葡聚糖水平。結(jié)果判斷：<70.00 pg/mL為陰性，70.00～95.00 pg/mL為可疑，>95.00 pg/mL為陽(yáng)性。

1.2.3超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和降鈣素(PCT)檢測(cè) 一次性真空管采集患者靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清備用，采用干式熒光免疫法檢測(cè)hs-CRP和PCT水平，hs-CRP參考區(qū)間為0.00～1.00 mg/L，PCT參考區(qū)間為<0.10 ng/mL。

1.2.4結(jié)果與解釋 血清GM、真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT檢測(cè)值均選取數(shù)值差異較大的兩點(diǎn)，中間檢測(cè)數(shù)值差異不大的數(shù)值不作顯示。真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT聯(lián)合升高提示酵母菌感染；血清GM、hs-CRP和PCT聯(lián)合升高提示曲霉菌感染，但若結(jié)合微生物培養(yǎng)結(jié)果可提示馬爾尼菲籃狀菌感染。

1.3儀器 法國(guó)梅里埃公司VTIEK MS質(zhì)譜儀，法國(guó)梅里埃公司血培養(yǎng)儀、培養(yǎng)箱，福建艾美益A5000全自動(dòng)干式熒光免疫分析儀，天津丹娜生物TECAN Sunrise全自動(dòng)酶免分析儀，TEOMEA2生物安全柜，西安天隆PCR擴(kuò)增儀。

1.4生物安全防護(hù) 檢驗(yàn)人員采取三級(jí)防護(hù)措施，穿隔離服，戴N95口罩和雙層橡膠手套，配置負(fù)壓獨(dú)立房間及外排式A2生物安全柜。標(biāo)本的接種及涂片，菌種鑒定及上質(zhì)譜儀前處理、藥敏試驗(yàn)前處理均在生物安全柜中操作，待靶板干燥10 min后移出生物安全柜上質(zhì)譜儀，標(biāo)本培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)需要一層包裝經(jīng)75%乙醇消毒后移出生物安全柜放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在不影響鑒定結(jié)果的前提下，所用試劑在上機(jī)前必須經(jīng)過(guò)紫外線照射30 min消毒。血清標(biāo)本3 000 r/min離心10 min后打開(kāi)離心機(jī)蓋前需要靜置10 min,取出真空管打開(kāi)蓋子后需要靜置10 min才可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行操作，防止產(chǎn)生氣溶膠污染，條件允許可盡量在生物安全柜中配置小型離心機(jī)操作。醫(yī)療廢物必須按照醫(yī)院高危醫(yī)療廢物醫(yī)療條例進(jìn)行高壓滅菌處理。

2 結(jié) 果

2.1微生物檢查結(jié)果 COVID-19并發(fā)真菌感染時(shí)間表見(jiàn)表1。

表1 COVID-19并發(fā)真菌感染時(shí)間表

2.2血清GM和真菌(1-3)-β-D葡聚糖檢測(cè)結(jié)果 GM試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果從3月10日至5月4日，待測(cè)樣本指數(shù)I一直在0.50以下，結(jié)果陰性，至5月10日，待測(cè)樣本指數(shù)I突然增加到5.00，結(jié)果陽(yáng)性。真菌(1-3)-β-D葡聚糖試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果從3月10日至3月29日，結(jié)果均在70.00 pg/mL以上，4月25日起開(kāi)始下降至70.00 pg/mL，結(jié)果之后一直陰性。見(jiàn)圖1。

圖1 血清GM和真菌(1-3)β-D葡聚糖檢測(cè)曲線圖

2.3hs-CRP和PCT檢測(cè)結(jié)果 hs-CRP檢測(cè)結(jié)果的峰值出現(xiàn)在3月18日和5月4日，分別為200.00 mg/L和139.92 mg/L，檢測(cè)低值在4月25日為45.11 mg/L，檢測(cè)結(jié)果在病情穩(wěn)定期高于正常范圍的50倍左右，若在病情變化期高于正常范圍的80～200倍。PCT檢測(cè)結(jié)果的峰值出現(xiàn)在3月18日，為17.22 ng/mL，之后開(kāi)始回落，直到5月4日出現(xiàn)上升趨勢(shì)，從5.29 ng/mL上升到5月10日的6.68 ng/mL，檢測(cè)低值在3月29日為1.63 ng/mL。檢測(cè)結(jié)果在病情穩(wěn)定期高于正常范圍的20倍左右，若在病情變化期高于正常范圍的40～60倍。見(jiàn)圖2。

圖2 血清hs-CRP和PCT檢測(cè)曲線圖

3 討 論

COVID-19是一種高傳染性呼吸道疾病，具有潛伏期長(zhǎng)、臨床癥狀多的特征，根據(jù)患者感染的病情分為無(wú)癥狀感染者、輕癥型、普通型、重型、危重型。據(jù)報(bào)道，老年人重型COVID-19的發(fā)病率和病死率明顯高于其他年齡組[6-8]。老年重型COVID-19由于病情反復(fù)危重，使用抗菌藥物治療周期長(zhǎng)，免疫功能低下，常采用長(zhǎng)期導(dǎo)管治療并不間斷侵入性治療手段等，并發(fā)癥較常見(jiàn)。馬爾尼菲籃狀菌是唯一一種雙相型青霉菌，微生物培養(yǎng)其菌落在28 ℃培養(yǎng)為玫瑰紅青霉樣，在37 ℃培養(yǎng)為酵母樣，正因其具有深部感染的致病力，且感染形式多為血流感染，所以形成菌血癥后可全身播散性傳播，病情發(fā)展迅速，病死率高。謝寧[9]報(bào)道顯示，97%的馬爾尼菲籃狀菌感染者為免疫功能缺陷的艾滋病人群，但在COVID-19并發(fā)尚屬首例,臨床治療首選兩性霉素B聯(lián)合使用伊曲康唑，有效率為77.3%[10]。

真菌(1-3)-β-D葡聚糖是真菌中細(xì)胞壁的多聚糖組分，如假絲酵母菌、曲霉菌、鐮刀菌等，是一種真菌廣譜循環(huán)標(biāo)志物。GM是曲霉菌細(xì)胞壁的主要成分，其釋放量與菌量成正比，反應(yīng)感染的程度。相關(guān)報(bào)道顯示，GM試驗(yàn)對(duì)馬爾尼菲籃狀菌感染有一定的診斷價(jià)值[11]，與馬爾尼菲籃狀菌細(xì)胞壁有交叉反應(yīng)。真菌(1-3)-β-D葡聚糖試驗(yàn)結(jié)果跟真菌培養(yǎng)檢出酵母樣真菌的時(shí)間基本相符，GM試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性的時(shí)間與馬爾尼菲籃狀菌培養(yǎng)出現(xiàn)時(shí)間相符。 hs-CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，可及時(shí)預(yù)測(cè)肺部的炎性反應(yīng)狀態(tài)及損傷情況，其作用時(shí)激活補(bǔ)體，加強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬病原微生物的功能，當(dāng)血清水平快速升高時(shí)，就是病原微生物感染加重的表現(xiàn)。PCT是一種無(wú)激素活性的糖蛋白，由甲狀腺濾泡旁的C細(xì)胞分泌，當(dāng)機(jī)體發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)大量釋放入血液，但在病毒感染時(shí)無(wú)變化，可用于細(xì)菌性肺炎的鑒別[12-14]。但hs-CRP和PCT影響因素較多，腫瘤、組織損傷、自身免疫病等均會(huì)引起升高。在病情穩(wěn)定期，hs-CRP檢測(cè)結(jié)果高于正常范圍的50倍左右，PCT檢測(cè)結(jié)果高于正常范圍的20倍左右,分別出現(xiàn)在COVID-19并發(fā)感染得到控制期和COVID-19陰轉(zhuǎn)后病情好轉(zhuǎn)期，hs-CRP的升高可能與患者肺部損傷短時(shí)期內(nèi)未完全康復(fù)或已造成不可逆性損傷有關(guān)。而PCT的升高可能與嗜麥芽窄食單胞菌一直未清除有關(guān)；hs-CRP和PCT檢測(cè)的峰值出現(xiàn)時(shí)間一致，并與微生物學(xué)培養(yǎng)出白色假絲酵母菌和馬爾尼菲籃狀菌時(shí)間基本吻合，其峰值對(duì)出現(xiàn)新并發(fā)感染有提示作用。

通過(guò)觀察，真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP和PCT的峰值均出現(xiàn)在3月18日，為檢出近平滑假絲酵母菌前2 d，培養(yǎng)時(shí)間一般為3～4 d，考慮為感染引起。后面曲線均有所回落。3月29日真菌(1-3)-β-D葡聚糖有一次小高峰但并沒(méi)有引起hs-CRP和PCT的升高，考慮為患者自身免疫力的提高，可見(jiàn)在3月23日SARS-CoV-2陰轉(zhuǎn)后，酵母樣真菌定植，病情得到控制。從4月28日始，hs-CRP逐步上升而PCT沒(méi)有明顯變化，但到5月4日hs-CRP和PCT同時(shí)出現(xiàn)高峰，PCT檢測(cè)值升高了一倍并維持高水平，距離5月2日血液檢測(cè)出馬爾尼菲籃狀菌僅僅2 d時(shí)間，往前推5 d的送檢時(shí)間，4月28日即為馬爾尼菲籃狀菌血流感染期，hs-CRP上升明顯且迅速，PCT上升卻有所延后，而血清GM在5月4日的檢測(cè)值為0.37(陰性)，5月6日多部位標(biāo)本檢出馬爾尼菲籃狀菌,GM檢測(cè)值>5.00(陽(yáng)性)。由此可見(jiàn)，馬爾尼菲籃狀菌血流感染期到全身散播感染僅為10 d左右，病情兇險(xiǎn)，發(fā)展迅速。hs-CRP和PCT第1次峰值(3月18日)上升幅度較高，可能與SARS-CoV-2未除，同時(shí)并發(fā)細(xì)菌和新發(fā)假絲酵母菌相關(guān)，第2次峰值(5月4日)上升幅度較第1次低，考慮SARS-CoV-2已除，但細(xì)菌和酵母樣真菌定植，新發(fā)馬爾尼菲籃狀菌感染引起；兩次升高中hs-CRP的幅度均較PCT高，這跟COVID-19引起肺部損傷引起hs-CRP基礎(chǔ)升高有關(guān)，而PCT的升高跟肺部損傷和病毒無(wú)關(guān)，只跟細(xì)菌或真菌等感染有關(guān)。本文研究對(duì)象是一位老年危重型COVID-19并發(fā)感染馬爾尼菲籃狀菌患者，抗菌藥物使用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3個(gè)多月，頭孢類、培南類和萬(wàn)古霉素類抗菌藥物的使用廣泛地抑制了大多數(shù)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。因此，并發(fā)感染對(duì)這幾類抗菌藥物耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌，同時(shí)出現(xiàn)假絲酵母菌共同感染；卡泊芬凈和米泊芬凈是一種細(xì)胞毒作用藥物，多用于惡性腫瘤患者，可同時(shí)作用于病毒、細(xì)菌、真菌及人體正常細(xì)胞，一直用于COVID-19整個(gè)治療期間。由于嗜麥芽窄食單胞菌和白色假絲酵母菌均為條件致病菌，若患者免疫功能提高有可能自愈，故臨床一直致力于提升患者整體免疫力，未使用相應(yīng)抗真菌藥物，同時(shí)有2個(gè)月的導(dǎo)管侵入性治療可能是馬爾尼菲籃狀菌潛伏生長(zhǎng)，從而引起血流感染的原因。

總之，長(zhǎng)期使用多種抗菌藥物、細(xì)胞毒類藥物治療COVID-19并發(fā)感染和侵入性器械治療是導(dǎo)致馬爾尼菲籃狀菌感染的原因，微生物檢查是“金標(biāo)準(zhǔn)”，聯(lián)合使用hs-CRP、PCT和GM檢測(cè)可提前預(yù)測(cè)馬爾尼菲籃狀菌散播性感染。因此,在治療COVID-19危重癥時(shí)，臨床若長(zhǎng)期使用以上治療手段，建議在后期治療中加強(qiáng)微生物血培養(yǎng)、真菌(1-3)-β-D葡聚糖、hs-CRP、PCT和GM的檢測(cè)，同時(shí)及早使用兩性霉素B治療，防止COVID-19并發(fā)馬爾尼菲籃狀菌感染。