甘薯渣酶解制備高純度結(jié)晶葡萄糖和可溶性膳食纖維的研究

石帥帥， 席 毅， 倪 賀， 呂鎮(zhèn)城， 陳兆貴， 李海航*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631; 2. 惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 惠州 516007)

甘薯(IpomoeabatatasLan)為旋花科的食藥兩用植物. 據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)2015年的統(tǒng)計，中國的甘薯種植面積約為560萬hm2，年產(chǎn)量約1億t，分別占世界的70%和85%[1]. 甘薯除含有大量淀粉外，還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、多酚、花色素苷、β-胡蘿卜素、黃酮、粘液蛋白、去氫表雄酮，食用纖維等[2-6]. 甘薯具有多方面的藥理功能，包括降血糖、降血脂、減肥、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗菌性、抗氧化和抗突變等[7-12].

我國甘薯產(chǎn)量約50%用于加工生產(chǎn)淀粉，加工過程中會產(chǎn)生大量的廢水和廢渣. 這些廢渣未被利用，造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[13]. 據(jù)報道，每生產(chǎn)1 t甘薯淀粉大約產(chǎn)生1.3 t甘薯渣. 甘薯渣中殘留的淀粉含量可高達(dá)其干質(zhì)量的61%[14]，具有較高的利用價值. 近年來，對于甘薯渣資源的開發(fā)利用研究主要集中在制備膳食纖維、糖漿，或者用來發(fā)酵制備乙醇、氫氣等[15-18].

本課題組研究和開發(fā)出了甘薯廢水中全部生化成分的高效和高價值分離回收方法和工藝[3-5]. 本研究采用酶解法將甘薯渣中的淀粉完全水解成葡萄糖，并經(jīng)過除雜和結(jié)晶得到超高純度的藥用級結(jié)晶葡萄糖，水解后的剩余物加入纖維素酶處理，可制備含可溶性膳食纖維較高的纖維制品，為甘薯渣的高價值利用提供了切實(shí)可行的方法.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用甘薯品種為一點(diǎn)紅(產(chǎn)地廣東)，購自廣州白云區(qū)江南果蔬批發(fā)市場. 葡萄糖標(biāo)品和糖化酶(10萬U/g)購自上海源葉生物科技有限公司. 耐高溫α-淀粉酶購自麥克林公司. 95%乙醇(食用級)購自廣州成碩化玻有限公司. 乙腈為色譜級，購自Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA)；其他化學(xué)試劑均為分析純或者生化試劑，購自廣州化學(xué)試劑廠.

1.2 葡萄糖的定量分析

用高效液相色譜儀對葡萄糖進(jìn)行定量分析. 檢測器為示差折光檢測器；液相色譜柱為Hpersil APS-2 NH2柱(4.6×250 mm, 5 μm)；流動相為V(乙腈)∶V(水)=85∶15；流速0.75 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)量為10 μL. 用不同質(zhì)量濃度的超高純結(jié)晶葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(10、20、30、40、50 g/L)制作質(zhì)量濃度和峰面積之間的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的峰面積計算樣品中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液與其峰面積之間關(guān)系的線性回歸方程為：y=75.797x-8.57，R2=0.999 9. 在此條件下，葡萄糖可與其它單糖類物質(zhì)達(dá)到良好的基線分離，葡萄糖在10～50 g/L的范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度和峰面積之間有良好的線性關(guān)系.

1.3 酶解條件的優(yōu)化

稱取20 g新鮮的濕甘薯渣，加入1倍體積的水和一定量耐高溫α-淀粉酶，加熱液化一定時間后再加入糖化酶酶解一定時間，在室溫下5 000 r/min離心10 min，取上清液得到酶解葡萄糖溶液，測定其葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.4 酶解葡萄糖的純化

配制500 g/L的酶解葡萄糖溶液，分別加入1%、2%、3%、4%和5%的大孔樹脂或聚酰胺，攪拌吸附3 h后離心，分離出溶液. 用紫外分光光度計在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描溶液的吸收光譜. 根據(jù)溶液的吸光強(qiáng)度分析溶液中雜質(zhì)的脫除效果.

1.5 葡萄糖的結(jié)晶

配制不同質(zhì)量濃度的酶解葡萄糖溶液，在65 ℃下加熱30 min，加入少量的葡萄糖晶種，超聲處理20 min后，在4 ℃下結(jié)晶. 結(jié)晶出的葡萄糖用少量95%乙醇洗去微量殘留的雜質(zhì)，在真空干燥箱中烘干.

1.6 酶解制備可溶性膳食纖維

取1 g水解后的殘渣干粉，加入15 mL的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4)，再加入纖維素酶，加熱保溫一段時間后8 000 r/min離心10 min，上清液加入4倍體積95%乙醇，沉淀過夜，離心分離. 沉淀即為可溶性膳食纖維.

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，并計算標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果分析與討論

2.1 α-淀粉酶酶解條件的優(yōu)化

測定了α-淀粉酶添加量對酶解液中葡萄糖產(chǎn)生的影響. 酶添加量在10～50 U/g范圍內(nèi)(圖1A)，酶解的葡萄糖量隨α-淀粉酶的增加而有所提高，但增加的幅度不大. 酶添加量為10、50 U/g時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為59.1、68.2 g/L，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,考慮到工業(yè)生產(chǎn)時酶的成本較高，選擇α-淀粉酶的用量為20 U/g.

在60～90 ℃范圍內(nèi)，隨著液化溫度的增加，酶解液中的葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增加，從60 ℃時的56.5 g/L增加到90 ℃時65.5 g/L(圖1B). 但當(dāng)液化溫度進(jìn)一步升高到100 ℃時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度不再增加, 加熱溫度為60 ℃和90 ℃的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義. 因此，選擇90 ℃作為α-淀粉酶液化的最適溫度.

在上述優(yōu)化的α-淀粉酶添加量和90 ℃的酶解溫度下，測定了酶解時間對葡萄糖產(chǎn)生量的影響(圖1C). 當(dāng)液化時間為30 min時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為62.0 g/L，隨著液化時間的延長，葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增大，當(dāng)液化時間為60 min時，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到65.8 g/L. 此后再延長液化時間，溶液中的葡萄糖質(zhì)量濃度不再增加，表明淀粉已經(jīng)完全被液化. 酶解60 min為α-淀粉酶液化的最佳時間.

圖1 甘薯渣酶解制備葡萄糖的液化條件優(yōu)化

2.2 糖化酶酶解條件的優(yōu)化

研究和優(yōu)化了糖化過程中糖化酶的加入量、酶解溫度和酶解時間. 當(dāng)糖化酶的加入量為100 U/g時(圖2A)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為51.1 g/L，當(dāng)糖化酶的加入量增加到200、300和400 U/g時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度變化不大，分別為52.3、53.8、54.0 g/L. 當(dāng)糖化酶的加入量為500 U/g時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度有較大的提高，達(dá)到57.8 g/L. 糖化酶加入量為500 U/g，與其他組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,考慮到大量生產(chǎn)時酶的成本較高，選擇300 U/g作為糖化酶的用量.

測定了40～80 ℃的溫度范圍內(nèi)糖化酶的糖化效果. 在40 ℃時(圖2B)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為46.9 g/L. 隨著溫度的升高，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增加. 當(dāng)糖化溫度為60 ℃時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最高(49.7 g/L). 此后，隨著溫度的升高，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度則迅速降低,酶解溫度為80 ℃時與其他組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義. 60 ℃為糖化酶處理的最佳溫度.

當(dāng)糖化時間為3 h(圖2C)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為41.2 g/L,延長糖化時間到6、9、12 h時，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度變化不大，約為43 g/L. 當(dāng)糖化時間進(jìn)一步延長到24 h時，酶解液中麥芽糖的質(zhì)量濃度仍有少量的增加，至46.8 g/L. 加熱3 h與24 h之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,考慮到工業(yè)生產(chǎn)時的效率，選擇糖化酶的糖化時間為6 h. 如條件許可，糖化時間可延長至24 h.

圖2 甘薯渣酶解制備葡萄糖的糖化條件優(yōu)化

2.3 葡萄糖的純化

水解后的糖溶液含有非糖類雜質(zhì)，呈淺黃色. 因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)在紫外區(qū)沒有吸收峰，可以通過紫外吸收光譜來檢測溶液中非糖類物質(zhì)的脫除效果. 實(shí)驗(yàn)測定和比較了在糖溶液中加入不同量的聚酰胺和大孔樹脂對溶液中非糖類物質(zhì)的吸附脫除效果(圖3A、B). 大孔樹脂吸附有紫外吸收的雜質(zhì)的效果顯著優(yōu)于聚酰胺吸附效果. 大孔樹脂在添加量為1%、2%、3%、4%和5%時都能顯著降低水解液的紫外吸收，但隨著大孔樹脂用量的增加，葡萄糖的損失也逐漸增加. 綜合考慮吸附除雜效果和葡萄糖的損失，選擇在水解后的葡萄糖溶液中加入1%的大孔樹脂，除去大部分非糖類雜質(zhì)，此時葡萄糖的損失很少.

圖3 聚酰胺和大孔樹脂吸附除去酶解葡萄糖溶液雜質(zhì)的效果

2.4 結(jié)晶制備超高純度葡萄糖

實(shí)驗(yàn)測定了酶解葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葡萄糖晶種的加入量和結(jié)晶時間對葡萄糖結(jié)晶效果的影響. 當(dāng)酶解葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(圖4A)，結(jié)晶得到的葡萄糖純度為97.6%，結(jié)晶回收率為56.3%. 隨著葡萄糖漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，結(jié)晶出的葡萄糖的純度及回收率都有所增加，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時，結(jié)晶得到的葡萄糖純度為99.1%，回收率達(dá)到89.4%；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時，盡管結(jié)晶回收率提高至92.8%，但結(jié)晶出的葡萄糖純度則下降到94.3%；當(dāng)葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，無法結(jié)晶出葡萄糖. 該結(jié)果表明，葡萄糖結(jié)晶的最佳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%.

測定了葡萄糖晶種的加入量對其結(jié)晶效果的影響. 在晶種加入量為1%～5% 的范圍內(nèi)(圖4B)，隨著晶種加入量的增加，結(jié)晶出的葡萄糖純度和回收率沒有顯著的變化. 結(jié)晶出的葡萄糖純度均達(dá)到99.0%，葡萄糖的回收率均為92.0%. 據(jù)此，確定在葡萄糖結(jié)晶時晶種的加入量為1%.

在12～96 h范圍內(nèi)(圖4C)，測定了結(jié)晶時間對葡萄糖結(jié)晶效果的影響. 當(dāng)結(jié)晶時間為12 h時，結(jié)晶出的葡萄糖純度為97.7%，葡萄糖的回收率為81.7%；隨著結(jié)晶時間的延長，結(jié)晶出的葡萄糖純度略有提高，回收率亦有顯著的增加；當(dāng)結(jié)晶時間為48 h時，得到的葡萄糖純度為99.3%，糖的回收率達(dá)到91.1%；此后，繼續(xù)延長結(jié)晶時間，結(jié)晶出的葡萄糖純度和回收率均無顯著變化. 因此，葡萄糖結(jié)晶的最佳時間為48 h.

圖4 葡萄糖結(jié)晶條件的優(yōu)化

2.5 制備可溶性膳食纖維條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)測定了纖維素酶加入量、溶液的pH值、加熱溫度和加熱時間對制備高可溶性膳食纖維的影響(圖5). 不加纖維素酶的樣品中僅提取出2%的可溶性膳食纖維(圖5A)；隨著纖維素酶加入量的增加，可溶性膳食纖維的得率增加；當(dāng)纖維素酶加入量為150 U/g時，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到7.1%；此后，再增加纖維素酶，可溶性膳食纖維的得率趨于不再增加. 因此，確定纖維素酶的最佳加入量為150 U/g.

測定了溶液的pH對可溶性膳食纖維含量的影響(圖5B). 溶液的pH為4.0時，可溶性膳食纖維的得率為10%；隨著溶液pH的升高，樣品中可溶性膳食纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高；pH為5.5時，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高值20.5%；此后，繼續(xù)升高pH，可溶性膳食纖維得率開始下降. 因此，確定溶液的最佳pH為5.5.

隨著反應(yīng)溫度的升高，可溶性膳食纖維的得率先升高后降低(圖5C). 當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高的15.9%；此后，繼續(xù)升高溫度，可溶性膳食纖維的得率則逐漸降低. 因此，確定了酶解反應(yīng)的最適溫度為40 ℃.

隨著酶解時間的延長，可溶性膳食纖維的得率逐漸增加(圖5D)，至180 min時，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高的16.4%. 此后，繼續(xù)延長酶解時間，可溶性膳食纖維的得率趨于穩(wěn)定. 因此，確定酶解反應(yīng)的最佳時間為180 min.

圖5 可溶性膳食纖維制備條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)確定利用水解后剩余的甘薯殘渣酶解制備含可溶性膳食纖維的最佳條件為：甘薯殘渣加入150 U/g的纖維素酶，在pH 5.5，反應(yīng)溫度40 ℃的條件下反應(yīng)180 min，此時殘渣中提取可溶性膳食纖維的得率由2%提高至20%.

3 討論

甘薯是我國重要的農(nóng)作物，產(chǎn)量占世界甘薯總產(chǎn)量的80%左右. 我國的甘薯約一半用于生產(chǎn)淀粉,每生產(chǎn)1 t的淀粉，約產(chǎn)生1.3 t的廢棄甘薯渣. 甘薯渣中含有大量的淀粉、膳食纖維和少量的蛋白質(zhì)，具有潛在的利用價值. 甘薯渣干質(zhì)量中淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均約為40%，可用于制備糖類物質(zhì). 葡萄糖是能夠直接被生物體吸收利用的一種糖類，是人體所需能量的主要來源. 葡萄糖在醫(yī)藥上不僅可以制成注射液，結(jié)晶葡萄糖還可以用來生產(chǎn)葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鈣等醫(yī)用產(chǎn)品；在食品中是一種常用的食品添加劑. 膳食纖維是人體第七大營養(yǎng)素,在人體中發(fā)揮著重要的作用. 膳食纖維具有改善腸道菌群、降血壓和降血脂等多種生理功能,膳食纖維在食品等方面有著廣泛的應(yīng)用.

孟悅等[16]以玉米粉為原料,通過高溫酶解法進(jìn)行液化,同時利用正交試驗(yàn)法對糖化工藝的各項參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化. 此時,經(jīng)檢測得到糖化液DE值為98.24%,DX值為98.16%. 吳允山等[17]以甘薯生產(chǎn)淀粉后的殘渣為原料，加入耐高溫α-淀粉酶、糖化酶以及纖維素酶對甘薯渣進(jìn)行處理，然后分別對其進(jìn)行保溫和滅酶處理，對固液分離得到的溶液進(jìn)行純化，可以得到葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%左右的糖漿. 最終得到的是葡萄糖漿，沒有做進(jìn)一步的純化結(jié)晶，同時酶解制備葡萄糖后剩余的纖維素仍沒有利用. 孫建等[19]利用超聲波技術(shù)和纖維素酶共同處理甘薯渣，最終制備的樣品中膳食纖維的得率為39.17%，其中可溶性膳食纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅達(dá)到13.49%. 本研究僅利用耐高溫的α-淀粉酶和糖化酶對甘薯渣中的淀粉進(jìn)行完全水解，并將得到的葡萄糖溶液進(jìn)行純化結(jié)晶制備高純度結(jié)晶葡萄糖. 對最終剩余的殘渣檢測發(fā)現(xiàn)，其中已經(jīng)不含淀粉，表明甘薯渣中的淀粉完全水解. 剩余的物質(zhì)僅含纖維素，可經(jīng)過進(jìn)一步的處理用于含可溶性膳食纖維較高的纖維素制品的開發(fā). 本研究在制備高純度結(jié)晶葡萄糖的同時，又對甘薯渣廢棄資源進(jìn)行深度的開發(fā)利用，既增加甘薯加工產(chǎn)業(yè)附加利潤，又減少了甘薯加工生產(chǎn)過程中造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染.

4 結(jié)論

本研究建立和優(yōu)化了甘薯渣酶解制備超高純度結(jié)晶葡萄糖的方法和工藝. 新鮮甘薯渣加等量水混勻，先加入20 U/g的耐高溫α-淀粉酶，在90 ℃下酶解液化60 min；然后加入300 U/g的糖化酶，60 ℃下酶解糖化6 h；甘薯渣中的淀粉可完全水解成葡萄糖,水解后的葡萄糖溶液加入1%的大孔樹脂吸附除去雜質(zhì)，將溶液的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)至70%，65 ℃加熱30 min后，加入1%的葡萄糖晶種，在4 ℃結(jié)晶48 h；結(jié)晶出的葡萄糖用95%乙醇清洗微量殘留雜質(zhì)后，烘干，得到純度為99.0%以上的醫(yī)用級結(jié)晶葡萄糖；殘渣加入150 U/g的纖維素酶，在pH 5.5、反應(yīng)溫度40 ℃的條件下反應(yīng)180 min，殘渣中提取可溶性膳食纖維的得率由2%提高至20%. 本研究為廢棄甘薯渣的高效和高價值利用提供了可行的方案.