擬南芥BLI基因調(diào)控植物衰老的研究

高 璐， 黃瑞華， 張盛春

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

BLISTER蛋白(BLI)共有714個氨基酸，其C末端在植物中高度保守，不同物種中具有高度序列相似性；第354至第527氨基酸區(qū)域序列與細(xì)菌中染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白的SMC結(jié)構(gòu)域有一定相似性，故被稱為類SMC蛋白結(jié)構(gòu)域. SMC蛋白質(zhì)參與了染色質(zhì)生物學(xué)的各種過程，包括染色體濃縮和DNA修復(fù)[1]；N末端蛋白序列為核定位和輸出信號以及細(xì)胞周期蛋白結(jié)合基序[2]. 缺失BLI可導(dǎo)致植物發(fā)育異常，其種子、葉和花的發(fā)育均受到影響，植株個體較小. 相比于同時期野生型植株，bli突變體植株種子表現(xiàn)出萌發(fā)延遲的現(xiàn)象，部分表皮細(xì)胞變?yōu)橛鷤M織. 萌發(fā)后，葉片出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，細(xì)胞大小和形狀不規(guī)則，粘附性降低. 在生殖生長時期，其花粉育性低，后代種子皺縮[2]. 研究[2]表明：BLI中C端類SMC蛋白結(jié)構(gòu)域與CLF蛋白中CXC結(jié)構(gòu)域有相互作用. 通過對bli突變體植株的轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)大量的脫落酸信號通路及許多應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，這些基因的差異性表達(dá)表明BLI作為擬南芥應(yīng)激反應(yīng)基因的關(guān)鍵調(diào)控因子抑制了脫落酸信號反應(yīng)的靶基因，參與了植物對寒冷及干旱等多種脅迫的響應(yīng)[3]. 除此之外，研究發(fā)現(xiàn)BLI蛋白是雙功能蛋白激酶/核糖核酸酶蛋白IRE1的負(fù)調(diào)控因子，通過直接或間接調(diào)控其他未知蛋白來抑制IRE1在營養(yǎng)生長過程中的功能，從而保證擬南芥植株的正常生長. IRE1是參與蛋白質(zhì)量監(jiān)控，折疊反應(yīng)UPR基因調(diào)控的因子，即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)折疊蛋白或錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中過多積累時，通過使蛋白質(zhì)折疊和降解能力與蛋白質(zhì)折疊需求相一致來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊蛋白的負(fù)荷[4]. 然而，正常生長條件下, UPR通路的過度激活會影響植物的生長發(fā)育.BLI的突變導(dǎo)致UPR基因表達(dá)上調(diào)，激活的IRE1會誘導(dǎo)UPR基因和其他非典型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因，導(dǎo)致植物生長遲緩以及細(xì)胞死亡[5].

植物雖然存在有分生組織，并且能夠利用自身組織實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)再利用從而處于不斷更新的狀態(tài), 但其仍隨著年齡增長而逐漸衰老[6]. 植物衰老是植物發(fā)育的最終階段[7], 通過體內(nèi)大分子的協(xié)同降解, 將成分轉(zhuǎn)移至植物生殖器官并最終轉(zhuǎn)移至種子, 從而實現(xiàn)世代延續(xù), 是一個復(fù)雜精妙、高度調(diào)控的年齡依賴性發(fā)育退化型過程[8]. 植物衰老引發(fā)的細(xì)胞死亡受植物年齡及其他內(nèi)外環(huán)境因素影響, 是一種主動的遺傳學(xué)調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過程. 研究[9]認(rèn)為, 細(xì)胞程序性死亡(PCD)是一種由相關(guān)因素影響誘發(fā)從而通過主動的遺傳調(diào)控介導(dǎo)的細(xì)胞自殺式過程. 目前已鑒定出許多衰老相關(guān)基因(SAGs), 超過800種基因被歸至SAGs衰老基因家族，超過400個轉(zhuǎn)錄因子在衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用[10]. 此領(lǐng)域?qū)W者的主要研究目標(biāo)為發(fā)現(xiàn)和分析各種衰老相關(guān)因子，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在衰老過程中的功能和調(diào)控機(jī)制, 以解析植物衰老相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 擬南芥突變體bli植株在整個發(fā)育過程中表現(xiàn)出的葉片衰老表型可作為研究植物衰老的一個良好實驗材料.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥Col-0；突變體bli(T-DNA插入突變體, Locus: AT3G23980)；BLI互補(bǔ)植株COM-1；BLI過表達(dá)植株OE-1；BLI啟動子表達(dá)模式分析植株pBLI∷GUS.

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素含量測定 快速稱取每種材料0.1 g并置于2 mL EP管中，迅速向管中加入預(yù)冷后的80% 丙酮研磨，磨后轉(zhuǎn)移至10 mL 試管中，加入預(yù)冷后的80% 丙酮至10 mL，扣緊蓋子后用錫紙密封整支試管，放于4 ℃冰箱浸提24 h. 浸提后收集上清液即為葉綠素提取液.

1.2.2 離子滲透率測定 稱取每種材料0.1 g，超純水漂洗3次以除去表面電解質(zhì). 將葉片擦干后用剪刀剪碎，放入加有10 mL超純水中的50 mL錐形瓶中，緊密封口后置于25 ℃的搖床中以180 r/min振蕩3 h；取出后利用純水電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率C1；測定之后重新緊密封口，沸水浴20 min；冷卻至室溫后測定電導(dǎo)率C2；測量超純水的電導(dǎo)率為C0；計算相對電導(dǎo)率：η=(C1-C0)/(C2-C0)×100%.

1.2.3 ROS誘導(dǎo)實驗 配制20 mmol/L的過氧化氫溶液，按時間梯度噴灑培養(yǎng)基中7日齡大小的野生型Col- 0植株，計時，按點迅速取出并于液氮中速凍，全部實驗組完成后提取RNA，并進(jìn)行后續(xù)實驗以檢測BLI表達(dá)量變化.

1.2.4 DAB、NBT染色 將實驗材料浸入裝有染色液的10 mL試管中，用錫紙將整支試管包裝好，于室溫條件下靜置12 h；將染好色的葉片置于75%乙醇中脫色，脫色后展開葉片，觀察拍照.

1.2.5 GUS染色 將相關(guān)實驗材料浸泡于裝有GUS染色液的試管中，抽真空10 min；用錫紙將整支試管包好后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，孵育一定時間后查看染上顏色即可取出.

1.2.6 RT-PCR基因表達(dá)量檢測

(1) 擬南芥總RNA的提取. 取實驗材料100 mg，液氮速凍，于1.5 mL EP管中加入1 mL Trizol試劑，放置冰上；將葉片于液氮預(yù)冷后的研缽中迅速研磨至粉末狀，移入有Trizol的EP管中，漩渦振蕩60 s，放置冰上；室溫靜置7 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清液至新的1.5 mL EP管中；加入200 μL的氯仿，立即劇烈振蕩20 s后室溫靜置3 min；4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液至新的EP管中，此時RNA存在于上層水相中；加入等體積異丙醇，顛倒混勻后，室溫放置10 min；4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，離心管底部可見白色沉淀，棄上清；加入1 mL 75% 乙醇(用DEPC處理過的無菌水配制)，洗滌沉淀；4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，棄上清液后放置濃縮干燥儀風(fēng)干殘余的酒精；加入30 μL的無菌水，60 ℃水浴10 min溶解RNA；分光光度計檢測其純度和濃度.

(2)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA. 在冰上將反應(yīng)液各組分混合，用移液器吹打至均勻；將樣品置于65 ℃反應(yīng)5 min，之后立即置于冰上反應(yīng)2 min；在冰上將反轉(zhuǎn)錄體系反應(yīng)液各組分混合，加入上述樣品中，用移液器吹打至均勻；將樣品置于42 ℃反應(yīng)90 min，再置于72 ℃反應(yīng)15 min.

(3)實時熒光定量PCR. 設(shè)計相關(guān)基因引物(表1)；配制樣品反應(yīng)體系，反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增曲線、溶解曲線及Cq值判定實驗結(jié)果是否可信，熒光定量PCR實驗均重復(fù)3次，每次3個重復(fù). 所用儀器為Bio-RAD公司7500 Fast Real-Time PCR system. 參考基因為ACTIN.

表1 引物對及序列Table 1 Primer pairs and sequences

1.3 本實驗中采用的引物對

2 實驗結(jié)果

2.1 突變體bli植株葉片表型分析

植物衰老是植物發(fā)育的最后階段. 在此階段中，葉綠素分解相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，光合色素如葉綠素、葉黃素及類胡蘿卜素的降解速率加快，植物葉片在形態(tài)上表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，是植物衰老的形態(tài)學(xué)標(biāo)志之一，因此觀察葉片黃化是一個直觀檢測葉片衰老的方法[10]. 正常情況下擬南芥在開花后蓮座葉逐漸出現(xiàn)黃化，但是部分bli突變體在培養(yǎng)基生長時期即出現(xiàn)黃色，不能正常生長，最終在培養(yǎng)基中衰老死亡. 比較同時期野生型Col-0植株，突變體bli在初期發(fā)育階段存活率低，可以繼續(xù)完成生長發(fā)育的植株整體矮小，且在4周齡時葉片開始黃化(圖1A). 而BLI互補(bǔ)植株COM-1中表型恢復(fù)正常，說明突變體bli植株的早衰表型確實是由于缺失BLI導(dǎo)致. 與此同時，與野生型Col-0相比，BLI過表達(dá)植株OE-1并未觀察到其他明顯表型(圖1B)，表明BLI基因并不存在劑量效應(yīng).

圖1 不同BLI基因型植株的葉片表型

2.2 突變體bli植株葉綠素含量及離子滲透率檢測

葉片黃化主要是因為植物細(xì)胞生理生化發(fā)生改變所引起的. 在葉片衰老初期，伴隨著葉綠體的降解，細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量不斷下降，衰老后期液泡膜等進(jìn)一步裂解導(dǎo)致胞內(nèi)離子滲漏，細(xì)胞導(dǎo)電性升高. 因此，通過定量測定葉片中葉綠素含量、離子滲透率可以進(jìn)一步驗證觀察到的衰老表型[10]. 針對本實驗中突變體bli植株表現(xiàn)出來的早衰現(xiàn)象，選取長勢較好的bli植株, 在其出現(xiàn)黃化葉片(約4周齡)的前后時間點檢測其葉綠素含量及離子滲透率, 并以相同時期相同培養(yǎng)條件下的野生型Col-0、BLI互補(bǔ)植株COM-1和BLI過表達(dá)植株OE-1作為對照. 結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)：bli植株在3周齡與其他植株比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，5周齡時出現(xiàn)葉綠素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他植株，離子滲透率高于其他植株的現(xiàn)象. 以上結(jié)果進(jìn)一步驗證了BLI缺失導(dǎo)致植株出現(xiàn)衰老表型.

圖2 不同BLI基因型葉綠素相對含量及離子滲透率

2.3 BLI表達(dá)模式分析

圖1、2表明突變體bli植株出現(xiàn)早衰表型，為了解析其相關(guān)的分子機(jī)制，對BLI的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測. 通過對10日齡的pBLI∷GUS植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)顯色，并于顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLI在幼苗的根、子葉等各種組織器官中均表達(dá)，并且根部顏色較深(圖3A). 為進(jìn)一步探究其在植株中不同組織的表達(dá)模式，提取同一批野生型Col-0植株種子、根、葉片、花、莖和莢果等不同組織器官中的RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了BLI的表達(dá)量(圖3B). 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BLI在各組織中均有表達(dá)，并且在莢果和根中的表達(dá)量最高.

圖3 BLI基因的組織表達(dá)模式分析

2.4 BLI基因與ROS的關(guān)系分析

植物的衰老往往伴隨著活性氧(ROS)的增加以及過氧化物酶活性的降低. 通過外源施加H2O2可降低葉片中超氧陰離子、丙二醛、抗壞血酸含量并增加谷胱甘肽、類黃酮含量，提高超氧化物歧化酶以及抗壞血酸過氧化物酶活性[10-11]. 為明確BLI蛋白和ROS之間的關(guān)系，通過外源施加H2O2檢測野生型植株BLI表達(dá)情況. 結(jié)果表明：20 mmol/L H2O2處理7日齡Col-0幼苗后，隨著處理時間的增加，BLI表達(dá)量逐步降低，在處理2 h后達(dá)到最低，為處理前的33.3%，之后無顯著變化(圖4A). 表明外源ROS能夠抑制BLI基因的表達(dá). 同時利用DAB(檢測H2O2)和NBT(檢測超氧陰離子)染色檢測了5周齡Col-0 和bli植株第5片葉片中ROS的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)bli突變體葉片中出現(xiàn)明顯的黃褐色(圖4B)和深藍(lán)色沉淀積累(圖4C)，表明突變體bli植物葉片中積累了較多的ROS. 以上結(jié)果表明BLI蛋白可能參與ROS介導(dǎo)的植物衰老過程.

圖4 BLI與ROS的關(guān)系分析

2.5 突變體bli植株衰老相關(guān)基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究BLI蛋白參與調(diào)控植物衰老的分子機(jī)制，分析了5周齡幼苗體內(nèi)衰老相關(guān)基因的表達(dá)情況.SAGs衰老基因家族中SAG12在葉片衰老后開始表達(dá)，并且其表達(dá)量隨衰老的加劇而增加; 另外SAG13、SAG101與衰老過程密切相關(guān)[10]. 結(jié)果顯示:在突變體bli植株中，衰老相關(guān)基因SAG12、SAG13和SAG101的表達(dá)顯著高于野生型植株，但是互補(bǔ)和過表達(dá)植株中SAGs表達(dá)與Col-0相比并無明顯差異(圖5A)，表明bli突變體提前進(jìn)入衰老階段. 在葉片衰老過程中,分解代謝逐漸取代合成代謝，同化物積累減少，光合作用中相關(guān)基因CAB1及LHCA1、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因RBCS表達(dá)下調(diào)[10]. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型植物相比，bli植株中光合作用相關(guān)基因LHCA1、RBCS和CAB1的表達(dá)明顯降低(圖5B)，該結(jié)果與葉片衰老生理生化變化特征一致. 以上結(jié)果表明BLI蛋白參與植物衰老過程，為解析其調(diào)控衰老的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

圖5 BLI植株衰老相關(guān)基因表達(dá)分析

3 討論

植物衰老是復(fù)雜精細(xì)且受嚴(yán)格調(diào)控的植物發(fā)育階段，是植物個體對內(nèi)源性發(fā)育以及外部環(huán)境信號的綜合反應(yīng). 植物通過協(xié)調(diào)細(xì)胞、組織、器官及組織水平上的各種穩(wěn)態(tài)，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)從葉片轉(zhuǎn)移至種子. 研究表明植物衰老受到多種正、負(fù)調(diào)節(jié)基因的調(diào)控. 迄今為止，已發(fā)現(xiàn)許多與衰老過程密切相關(guān)的基因，其中大多數(shù)基因被歸至SAGs基因家族. 目前也發(fā)現(xiàn)了不同家族的轉(zhuǎn)錄因子如WRKY、NAC等，是植物衰老的正調(diào)控因子[10].

植物衰老過程中伴隨著植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理生化特征的改變. 結(jié)構(gòu)改變的顯著特征是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)及細(xì)胞器的有序降解；生理生化變化首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)同化作用的下降，蛋白質(zhì)、DNA、RNA等生物大分子的分解代謝逐漸取代合成代謝，含量不斷減少，與此相關(guān)的降解酶活性增強(qiáng)；生物膜解體導(dǎo)致膜內(nèi)離子滲漏從而使細(xì)胞離子滲透率升高，葉綠素的降解導(dǎo)致植物光合速率不斷下降，超氧陰離子、H2O2等活性氧(ROS)的含量進(jìn)一步增加，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞，這些變化導(dǎo)致植物個體命運(yùn)走向終結(jié)[12]. 與野生型擬南芥植物相比，bli突變體葉綠素含量顯著下降，細(xì)胞離子滲透率顯著升高，DAB、NBT染色結(jié)果表明其體內(nèi)活性氧含量顯著升高，因此，bli突變體植株提前進(jìn)入衰老階段. 在衰老過程中，植株體內(nèi)與蛋白質(zhì)、核酸、糖類等生物大分子降解相關(guān)的基因以及衰老相關(guān)基因如SAG101等的表達(dá)在bli突變體中上調(diào)，而與光合作用、同化作用等合成代謝相關(guān)基因如LHCA1的表達(dá)則下調(diào). 生理生化及分子生物學(xué)研究結(jié)果表明BLI確實參與了植物葉片衰老的調(diào)控，并且BLI可能是衰老的正調(diào)控因子.

已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：植物受到脅迫時，其基因表達(dá)模式與植物衰老時基因表達(dá)模式密切相關(guān)，如水楊酸(SA)介導(dǎo)的植物衰老途徑與植物自然衰老途徑過程高度重疊. 近年來對脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、乙烯及水楊酸(SA)等內(nèi)源激素的研究發(fā)現(xiàn)，其廣泛參與植物個體對各種非生物以及生物脅迫的響應(yīng)，逐漸發(fā)現(xiàn)較多參與環(huán)境變化響應(yīng)的基因也調(diào)控植物衰老[13]，脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因也是衰老過程中被調(diào)控表達(dá)的基因，細(xì)胞分裂素的受體AHK3介導(dǎo)的ARR2磷酸化是調(diào)控細(xì)胞壽命的關(guān)鍵因子, 茉莉酸(JA)及茉莉酸甲酯(Me JA)可誘導(dǎo)植物衰老相關(guān)基因如SEN4、SEN5的表達(dá)，AtNAP轉(zhuǎn)錄因子通過直接誘導(dǎo)靶基因SAG113介導(dǎo)ABA誘導(dǎo)的葉片衰老等，已有的研究結(jié)果表明生物或非生物脅迫通過影響植物激素的合成進(jìn)而激發(fā)了共同參與脅迫與衰老響應(yīng)基因的表達(dá)，最終誘發(fā)植物衰老. 除此之外，蛋白質(zhì)泛素化降解過程也參與控制植物衰老，如?；饷竿ㄟ^破壞細(xì)胞膜的完整性、轉(zhuǎn)化酶在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用; 并且依賴于溶酶體和液泡的蛋白質(zhì)降解途徑即自噬(植物體在受到脅迫時由于營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，通過對體內(nèi)大分子的降解得到N源和C源以維持植物體的生物合成并促進(jìn)植物體內(nèi)物質(zhì)的再利用)過程也與衰老過程密切相關(guān)[14]. 鑒于目前研究發(fā)現(xiàn)BLI蛋白作為多種應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子參與了植物對環(huán)境的適應(yīng)性，因此可進(jìn)一步可探究擬南芥bli突變體與細(xì)胞自噬及水楊酸信號途徑介導(dǎo)的細(xì)胞衰老分子調(diào)控機(jī)制，以解析其在植物衰老分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制.

4 結(jié)論

相較于野生型Col-0植株，bli突變體植株中ROS含量升高，表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象；葉片黃化時間出現(xiàn)較早，在幼苗時期體內(nèi)葉綠素含量下降，離子滲透率升高，衰老相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，光合作用相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)；基因表達(dá)分析表明其在種子及根部中表達(dá)量較高，施加外源活性氧可降低BLI表達(dá)量. 本研究結(jié)果初步證明BLI參與植物衰老過程，但其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步的探究.