松材線蟲(chóng)脂滴4種染色方法的比較

黃林玲，周 湘，胡加付，林海萍，郭 愷

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophilus是公認(rèn)的檢疫性有害生物，破壞性地危害歐亞地區(qū)的松林資源[1]。松材線蟲(chóng)的生活史分為2個(gè)階段：繁殖階段和擴(kuò)散階段[2]。在溫度適宜的夏季和秋季，松材線蟲(chóng)進(jìn)入繁殖階段，在樹(shù)體內(nèi)經(jīng)過(guò)卵、繁殖型幼蟲(chóng)(J1～J4)，再發(fā)育為成蟲(chóng)。在不良環(huán)境條件下，松材線蟲(chóng)進(jìn)入擴(kuò)散階段，即滯育型周期，繁殖型J2會(huì)轉(zhuǎn)型發(fā)育為擴(kuò)散型J3幼蟲(chóng)和擴(kuò)散型J4幼蟲(chóng)，在此過(guò)程中體內(nèi)脂滴數(shù)量增加，并發(fā)生脂滴融合現(xiàn)象，形成超大脂滴或者塊狀脂肪[3]。擴(kuò)散型J4幼蟲(chóng)口針退化不取食，依靠消耗體內(nèi)超大脂滴作為能量侵染新的寄主植物。因此，脂滴對(duì)于松材線蟲(chóng)的生存和傳播都具有重要作用。中性脂肪(甘油三酯和膽固醇)在線蟲(chóng)中主要以脂滴的形式存在，是松材線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的主要儲(chǔ)存形式[4?6]。松材線蟲(chóng)的腸道是脂類(lèi)物質(zhì)沉積的主要場(chǎng)所。由于線蟲(chóng)蟲(chóng)體是透明的，可在顯微鏡下清楚地看到從頭部到尾部的整個(gè)腸道，是研究脂肪沉積的一種理想模型[7]。模式線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans可采用染料蘇丹黑B、尼羅紅和油紅O等方法檢測(cè)脂肪儲(chǔ)存和代謝，不同染色方法下脂肪含量的表征呈現(xiàn)一定程度的差異。利用脂溶性的染料蘇丹黑B來(lái)著色脂滴，脂滴在腸和皮下組織中可見(jiàn)。熒光染料尼羅紅和油紅O可將脂滴染成紅色[8]。目前在松材線蟲(chóng)中尚無(wú)相關(guān)脂滴染色研究報(bào)道，因此，本研究使用不同的染料標(biāo)記松材線蟲(chóng)體內(nèi)的脂滴分布，通過(guò)使用ImageJ軟件測(cè)量線蟲(chóng)脂滴的平均像素強(qiáng)度，來(lái)表征脂肪含量，確定適合松材線蟲(chóng)脂滴染色的方法[9]。

1 材料和方法

1.1 供試線蟲(chóng)和培養(yǎng)條件

松材線蟲(chóng)NXY61蟲(chóng)株為中國(guó)林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所從浙江省寧波市罹病馬尾松Pinus massoniana中分離獲得。使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)的灰葡萄孢Botrytis cinerea來(lái)培養(yǎng)繁殖型松材線蟲(chóng)[2]?；旌淆g期的繁殖型線蟲(chóng)置于PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d，在加入滅菌雙蒸水(ddH2O)的貝爾曼漏斗中將線蟲(chóng)從培養(yǎng)基上洗下來(lái)，3 000 r·min?1離心3 min，清除上清液。擴(kuò)散型3齡幼蟲(chóng)從當(dāng)年采集的疫木中分離，擴(kuò)散型4齡幼蟲(chóng)從媒介昆蟲(chóng)松墨天牛Monochamus alternatus體內(nèi)分離。

1.2 染色

1.2.1 蘇丹黑 B染色 將松材線蟲(chóng)用 M9緩沖液 (3.00 g KH2PO4, 6.00 g Na2HPO4, 5.00 g NaCl, 1 mL 1 mol·L?1MgSO4，加入蒸餾水定容至 1 L)洗滌離心 3次 (3 000 r·min?1，1 min)；將線蟲(chóng)置于含體積分?jǐn)?shù)為 1% 多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)的M9緩沖液中，4 ℃過(guò)夜；?80 ℃冰箱凍融3次；將M9洗滌固定的線蟲(chóng)經(jīng)梯度體積分?jǐn)?shù)乙醇(25%，50%和70%)分級(jí)脫水，每級(jí)5 min；隨后，在溶于體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇的蘇丹黑B溶液中進(jìn)行染色[10]。顯微鏡觀察和拍攝染色后的線蟲(chóng)，并對(duì)皮下和腸道內(nèi)染色的脂滴像素統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 尼羅紅染色 將線蟲(chóng)用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛溶液固定，使線蟲(chóng)細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定狀態(tài)[9]。線蟲(chóng)和多聚甲醛溶液混合，并于室溫?fù)u動(dòng)2～3 h后，靜置使線蟲(chóng)沉降；在?80 ℃冰箱凍融3次，固定后的線蟲(chóng)逐級(jí)脫水；在M9緩沖液的線蟲(chóng)沉淀中加入1 mL尼羅紅(1 mg·L?1)，在避光的環(huán)境下混勻并染色25～30 min，染色期間輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，使得蟲(chóng)體均勻接觸染料；用1×PBS(8.00 g NaCl，0.20 g KCl，1.44 g Na2HPO4和 0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 蒸餾水，用 HCl調(diào)節(jié)溶液 pH 至 7.4，最后加蒸餾水定容至1 L)清洗1次，去除線蟲(chóng)表面的染料，然后使線蟲(chóng)自然沉降。最后用顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 油紅O染色 用M9緩沖液將松材線蟲(chóng)洗至離心管中，在體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛室溫或4 ℃固定 15～30 min；然后置于?80 ℃ 冰箱中冷凍 15 min，在 43 ℃ 水浴中迅速解凍；低速離心 1 min，棄上清；用1×PBS沖洗3次，棄去PBS；用體積分?jǐn)?shù)為1%Triton X-100、異丙醇油紅O溶液浸泡30 min；用1×PBS沖洗3次。用異丙醇置于載玻片上，顯微鏡下觀察拍照[11]。

1.2.4 后置油紅O染色 使用改良的后置油紅O染色方案[12]。將油紅O溶于異丙醇，制成質(zhì)量濃度為5.00 g·L?1原液。采用混合法制備油紅O工作液(60%的原液和40%的水)。油紅O工作液靜置后用0.22 mm自旋過(guò)濾器過(guò)濾。將線蟲(chóng)用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛/PBS在室溫下固定搖動(dòng)30 min；然后立即將樣品在冰箱中冷凍干燥15 min，并在自來(lái)水中溶解，共3次；低速離心1 min，棄上清；用1×PBS洗滌樣品3次，用體積分?jǐn)?shù)為60%異丙醇脫水2 min；用1 mL油紅O工作液搖動(dòng)1 h進(jìn)行染色。染色后的樣品用1×PBS洗滌3次，再水合1×PBS，并安裝在瓊脂填充的載玻片上，顯微鏡觀察拍照。

1.3 顯微鏡和成像

用徠卡熒光正置顯微鏡(DM4B)使用40×物鏡觀察固定的尼羅紅、油紅O和蘇丹黑B染色的線蟲(chóng)，用CCD相機(jī)(DFC7000T)拍攝16位圖像，并用ImageJ(V2.1.4.7)進(jìn)行圖像處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇丹黑B和尼羅紅固定染色線蟲(chóng)效果

將固定后的蟲(chóng)體置于顯微鏡下觀察，與未染色線蟲(chóng)相比，蘇丹黑B染色線蟲(chóng)的腸道普遍被染成藍(lán)色(圖1)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用蘇丹黑B原溶液染色線蟲(chóng)如圖1A～B，顯微鏡下觀察到的脂滴邊界不清晰，整條成蟲(chóng)呈現(xiàn)深藍(lán)色；將蘇丹黑B稀釋60%，染色觀察如圖1C～D，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)脂滴邊界尚清楚，但仍會(huì)影響觀察松材線蟲(chóng)的脂滴動(dòng)態(tài)變化。

尼羅紅與蘇丹黑B共同標(biāo)記了腸道周?chē)闹?。尼羅紅染色線蟲(chóng)在顯微鏡下觀察到部分脂滴呈淺紅色(圖1E～H)。將配置的母液染料稀釋500倍，染色時(shí)間30 min，顯微成像效果不佳(圖1E～F)，大部分蟲(chóng)體脂滴染色不均，其中成蟲(chóng)的色澤較淺。當(dāng)提高工作液濃度，僅將母液稀釋了100倍，為5 mg·L?1,并將染色時(shí)間增加為1 h (圖1G～J)，可以分辨分布在成蟲(chóng)腸道周?chē)膱A形大脂滴，而幼蟲(chóng)的脂滴邊界相對(duì)比較模糊，不便于測(cè)量松材線蟲(chóng)脂滴的大小和脂肪存儲(chǔ)量。

圖1 蘇丹黑 B、尼羅河紅染色線蟲(chóng)中相同脂滴Figure 1 Sudan black B, fixed Nile red stained nematode in same lipid droplets

2.2 油紅O和后置油紅O染色線蟲(chóng)效果

在用油紅O與后置油紅O染色線蟲(chóng)時(shí)，培養(yǎng)的同步發(fā)育繁殖型線蟲(chóng)和野外采集的擴(kuò)散型線蟲(chóng)都呈現(xiàn)明顯的紅色脂滴(圖2)。油紅O染色如圖2A～D，可以觀察到，當(dāng)蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)較多脂滴時(shí)，單個(gè)脂滴未能良好分離，會(huì)影響測(cè)量松材線蟲(chóng)脂肪儲(chǔ)存量化及繁殖型與擴(kuò)散型松材線蟲(chóng)的脂滴大小的變化。用后置油紅O方法染色線蟲(chóng)結(jié)果如圖2E～J，在顯微鏡下觀察到脂滴邊界清晰，其中J2和J3幼蟲(chóng)大部分較小的脂滴分布在腸道和表皮，并能觀察到從幼蟲(chóng)J4到成蟲(chóng)出現(xiàn)小脂滴聚集成大脂滴的現(xiàn)象。擴(kuò)散型J3較大的脂肪塊與擴(kuò)散型J4脂質(zhì)小滴之間的脂滴大小變化十分明顯。

圖2 油紅 O、后置油紅 O 染色線蟲(chóng)中相同脂滴Figure 2 Oil red O，post-fix oil red O stained the same lipid droplets in B. xylophilus

2.3 脂滴染色圖片像素強(qiáng)度比較

通過(guò)光學(xué)顯微鏡捕獲的蘇丹黑B、尼羅紅、油紅O染色松材線蟲(chóng)脂滴圖片，用ImageJ進(jìn)行圖像處理，計(jì)算線蟲(chóng)脂滴圖片的平均像素強(qiáng)度。圖3結(jié)果顯示：蘇丹黑B和后置油紅O染色松材線蟲(chóng)脂滴的平均像素強(qiáng)度明顯高于尼羅紅和油紅O染色，其中蘇丹黑B染色后整條蟲(chóng)呈現(xiàn)藍(lán)色，所以脂滴平均像素強(qiáng)度最高，而尼羅紅的最低，因?yàn)轭伾^淺。這就說(shuō)明脂滴平均像素強(qiáng)度偏高或偏低都會(huì)影響表征脂肪。經(jīng)ImageJ圖像處理比較分析，后置油紅O染色脂滴經(jīng)計(jì)算轉(zhuǎn)換與原始圖像的一致，具有單個(gè)脂滴的良好分離(圖4)。

2.4 松材線蟲(chóng) 4種脂滴染色方法的比較

如表1所示：綜合考慮染色方法的簡(jiǎn)易性、染色時(shí)間的長(zhǎng)短[11]、染色的觀察效果，后置油紅O染色方法在4種染色方法中的染色時(shí)間相對(duì)較短，脂滴呈現(xiàn)的效果比較清晰，能實(shí)現(xiàn)脂滴的單個(gè)分離，方法步驟比較簡(jiǎn)單，認(rèn)為后置油紅O染色方法是松材線蟲(chóng)脂滴的最佳染色方法。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)使用染料標(biāo)記的不同測(cè)定法來(lái)探索松材線蟲(chóng)的最佳脂滴染色方法。在染色前，需要先對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行有效固定，多聚甲醛可很好地保存生物體組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)特征。固定以后，組織中的各種物質(zhì)會(huì)沉淀和凝固，產(chǎn)生不同的折射率，促使產(chǎn)生光學(xué)差異，方便染色后觀察。

油紅O、蘇丹黑B、尼羅紅染色一般都能觀察到線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存，但在本研究中呈現(xiàn)不同顯色效果。蘇丹黑B作為一種經(jīng)典的染料，在固定過(guò)程中經(jīng)乙醇的洗滌，無(wú)法標(biāo)記線蟲(chóng)中脂肪儲(chǔ)存[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)：蘇丹黑B染色松材線蟲(chóng)脂滴觀察效果不佳，染色時(shí)間也比較長(zhǎng)。尼羅紅是一種由尼古藍(lán)衍生的脂類(lèi)染料，在疏水環(huán)境時(shí)發(fā)熒光，既可染色脂滴，又可檢查完整活體動(dòng)物的脂肪含量[13?15]，經(jīng)常被作為秀麗隱桿線蟲(chóng)的脂肪酸代謝研究的染料標(biāo)記。最近研究還發(fā)現(xiàn)，鮮活的線蟲(chóng)經(jīng)尼羅紅染色沒(méi)有顯示染色模式的差異[12]。當(dāng)線蟲(chóng)被喂食尼羅紅時(shí)，染料會(huì)在與溶酶體有關(guān)的細(xì)胞器中積聚[16]，固定尼羅紅比喂食尼羅紅更能顯示脂肪儲(chǔ)存情況。本研究初期觀察到的脂滴色澤非常淺，甚至整條線蟲(chóng)未被染色，呈透明狀態(tài)，經(jīng)過(guò)多步實(shí)驗(yàn)探索，線蟲(chóng)中脂滴有部分染色，但仍有染色不完整的脂滴。而且由于尼羅紅是親水性染料，可能會(huì)染色脂褐素，導(dǎo)致固定染色不能將中性脂肪存儲(chǔ)區(qū)與脂褐素區(qū)分開(kāi)，影響結(jié)果[17]。油紅O是一種油溶性偶氮染料，溶于乙醇和丙酮，在脂肪內(nèi)能高度溶解，從而染色，顏色比較鮮紅，染色效果相對(duì)于前面2種染料要好。后置油紅O染色用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛的固定液在分子雜交爐中室溫條件搖動(dòng)30 min，通過(guò)搖動(dòng)，使線蟲(chóng)充分接觸固定液。將樣品放在?80 ℃冰箱中凍融3次，并在自來(lái)水中溶解，相比于油紅O染色(在43 ℃水浴中迅速解凍)，可增加線蟲(chóng)的緩沖性。在后置油紅O染色過(guò)程中，異丙醇脫水使線蟲(chóng)顯微成像時(shí)觀察到的組織結(jié)構(gòu)更清晰，用自旋過(guò)濾器過(guò)濾油紅O工作液，可以減少沉淀雜質(zhì)的產(chǎn)生。用瓊脂填充幻燈片成像，可以防止線蟲(chóng)干死，也可以更好地固定已染色的線蟲(chóng)。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)探究，油紅O染色之后，觀察到的大小脂滴聚集，脂滴邊界未能體現(xiàn)，紅色會(huì)成片區(qū)域出現(xiàn)，當(dāng)測(cè)量脂滴大小變化、脂滴數(shù)量時(shí)，會(huì)加大實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差；后置油紅O染色方法經(jīng)過(guò)改良，線蟲(chóng)在室溫下用體積分?jǐn)?shù)為1%多聚甲醛搖動(dòng)，并經(jīng)多次凍融以后用體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇脫水，染色效果比較理想，可直接觀察脂滴大小變化。綜上所述，后置油紅O染色方法是最佳松材線蟲(chóng)脂滴染色方法。