6個(gè)彩葉桂品種對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)

李呈呈，吳其超，馬 燕，栗雨昊，臧德奎

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 黃河下游國(guó)家林業(yè)和草原局林業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；2. 泰山學(xué)院 數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)院，山東 泰安 271000）

彩葉桂品種群Osmanthus fragrans Colour Group是近年來(lái)新培育的桂花新類型，其營(yíng)養(yǎng)體部分(即枝條和葉片)有著完全不同于綠色的明顯色彩變異，并能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間[1]。彩葉桂觀賞期更長(zhǎng)，園林用途更廣泛，未來(lái)前景十分廣闊。然而，由于低溫的限制，目前彩葉桂的栽培主要局限于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)，尚未得到有效的開(kāi)發(fā)應(yīng)用[2]。另外，迄今尚未有關(guān)于彩葉桂抗寒相關(guān)的系統(tǒng)研究，其抗寒品種的篩選和適宜種植的范圍尚不明確，這也極大地限制了彩葉桂的推廣和應(yīng)用。低溫是影響自然界植物正常生長(zhǎng)和分布的一項(xiàng)關(guān)鍵因素[3]，因此，研究低溫對(duì)植物的影響具有重要的價(jià)值。低溫環(huán)境中，植物細(xì)胞膜、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶等都會(huì)產(chǎn)生一系列變化以抵御低溫傷害。因此，通常采用相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶等生理指標(biāo)作為評(píng)價(jià)植物抗寒性的參考依據(jù)[4?5]。本研究以6個(gè)不同彩葉桂品種為試驗(yàn)材料，通過(guò)測(cè)定其相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化物酶活性等6項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，探討6種彩葉桂對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，完成部分彩葉桂的抗寒性評(píng)價(jià)。據(jù)此篩選適應(yīng)北方地區(qū)露地栽培的優(yōu)良彩葉桂品種，對(duì)彩葉桂的推廣和應(yīng)用具有一定的參考意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料均取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)試驗(yàn)站。6個(gè)彩葉桂品種為‘傲霜’‘Aoshuang’、‘冬榮’‘Dongrong’、‘羅彩1號(hào)’‘Luocai No.1’、‘羅彩2號(hào)’‘Luocai No.2’、‘永福幻彩’‘Yongfu Huancai’、‘銀碧雙輝’‘Yinbi Shuanghui’。2019年11月中旬，選擇各品種長(zhǎng)勢(shì)良好一致、無(wú)病蟲(chóng)害的4年生扦插苗，剪取1年生枝上第3～5節(jié)位大小均勻的葉片，用塑封袋裝好置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 低溫處理

將采回的葉片混勻，每個(gè)品種分成均勻的9份，設(shè)3次重復(fù)，洗凈并吸干水分，將1組放置在25 ℃室溫中進(jìn)行對(duì)照處理，另外8組放置在可控溫冰箱中，按照預(yù)設(shè)的8個(gè)溫度梯度(即0、?4、?8、?12、?16、?20、?24、?28 ℃)給予人工低溫處理。以隔10 min下降1 ℃的速度降溫，降到目的溫度后放置24 h，取出1組葉片在4 ℃冰箱中解凍8 h后測(cè)定。其余葉片繼續(xù)按設(shè)定梯度處理。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)法[6]，將各處理溫度下的相對(duì)電導(dǎo)率和各處理溫度的關(guān)系用Logistic方程進(jìn)行擬合[7]，當(dāng)擬合度顯著時(shí)計(jì)算拐點(diǎn)溫度即半致死溫度(TL50)，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用蒽酮法，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)比色法[8]，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶活性采用NBT法，過(guò)氧化物酶活性采用愈創(chuàng)木酚法[9]。

1.4 數(shù)據(jù)分析和綜合評(píng)價(jià)

應(yīng)用 Excel 2016、SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用單因素方差分析 (one-way ANOVA)和Duncan新復(fù)極差法(Duncan’s multiple-range)進(jìn)行差異顯著性分析，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同小寫(xiě)字母表示各品種內(nèi)不同低溫間在 P＜0.05水平上具有顯著性差異。

通過(guò)隸屬函數(shù)法對(duì)6個(gè)彩葉桂品種的抗寒性進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：

式(1)～(2)中：U(xij)為i品種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；xij為測(cè)定值；xjmax和xjmin分別為j指標(biāo)測(cè)定的最大值和最小值。式(1)用于計(jì)算指標(biāo)與抗寒性呈正相關(guān)的情況，式(2)用于計(jì)算呈負(fù)相關(guān)的情況[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì) 6個(gè)彩葉桂品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

從圖1可見(jiàn)：不同低溫脅迫下6個(gè)彩葉桂品種相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)較為相似，都隨溫度的下降逐漸升高。在輕度低溫脅迫時(shí)(0～?4 ℃)，相對(duì)電導(dǎo)率升高較為緩慢，處于較低水平；隨著溫度的進(jìn)一步下降(?4～?20 ℃)，電導(dǎo)率表現(xiàn)快速增加的趨勢(shì)。品種不同增幅不同?！栏；貌省茸钚?，是對(duì)照的6.16倍，‘傲霜’增加幅度最大，是對(duì)照的8.42倍，且各品種的相對(duì)電導(dǎo)率都已大于60%，說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的離子滲透；降溫后期(?20～?28 ℃)，各品種相對(duì)電導(dǎo)率增加幅度很小，可見(jiàn)脅迫后期植物葉片細(xì)胞膜已受到相當(dāng)嚴(yán)重破壞，幾乎全部的離子都已滲透到細(xì)胞外，植株接近死亡。

圖1 低溫脅迫下各品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率變化Figure 1 Changes of relative conducitivity in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

半致死溫度(TL50)在一定程度上能反映植物不同品種的耐寒能力。對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行 Logistic回歸分析(表1)，相關(guān)系數(shù)均大于0.8，擬合度良好，結(jié)果可信。通過(guò)公式TL50=lna/b(a、b為回歸方程的參數(shù))計(jì)算半致死溫度，不同品種彩葉桂抗寒性從大到小依次為‘傲霜’ ‘冬榮’ ‘羅彩2號(hào)’‘羅彩1號(hào)’ ‘永?；貌省?‘銀碧雙輝’。

表1 低溫脅迫下各品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率的回歸方程和半致死溫度Table 1 Regression equation of relative conductivity and TL50 in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

2.2 低溫脅迫對(duì) 6個(gè)彩葉桂品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響

低溫脅迫下，彩葉桂葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度隨溫度降低，總體上呈先增加后減少再增加的變化規(guī)律，并且各品種的變化幅度有所不同(圖2)。0 ℃時(shí)葉片中丙二醛與對(duì)照相比顯著上升，隨即出現(xiàn)下降，僅‘傲霜’在0 ℃時(shí)出現(xiàn)短暫下降，隨后又迅速上升，直到?12 ℃才又出現(xiàn)下降。隨著脅迫的加深，各品種在降溫后期丙二醛質(zhì)量摩爾濃度再次呈上升趨勢(shì)。上升幅度最大的為‘銀碧雙輝’，是對(duì)照的2.34倍，上升幅度最小的是‘傲霜’，是對(duì)照的0.88倍。

圖2 低溫脅迫下各品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度變化Figure 2 Changes of MDA content in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

2.3 低溫脅迫對(duì) 6個(gè)彩葉桂品種葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

在對(duì)彩葉桂葉片進(jìn)行人工低溫處理時(shí)，各品種可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上均表現(xiàn)出“升高—降低”的變化趨勢(shì)，但增加幅度和拐點(diǎn)溫度并不相同(圖3和圖4)。‘永?；貌省扇苄蕴枪拯c(diǎn)溫度最低，為?12 ℃，‘銀碧雙輝’和‘冬榮’拐點(diǎn)溫度最高，為0 ℃；可溶性糖增幅最大的是‘傲霜’，是對(duì)照的1.61倍，增幅最小的為‘銀碧雙輝’，是對(duì)照的1.06倍?！_彩1號(hào)’可溶性蛋白質(zhì)拐點(diǎn)溫度最低，為?12 ℃，‘永?；貌省_彩2號(hào)’拐點(diǎn)溫度最高，為0 ℃；可溶性蛋白質(zhì)增幅最大的是‘冬榮’，是對(duì)照的2.66倍，增幅最小的是‘羅彩2號(hào)’，是對(duì)照的1.15倍。總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)彩葉桂受到一定范圍的低溫脅迫時(shí)，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為增加，即2個(gè)指標(biāo)和植物的耐寒能力存在一定的正相關(guān)。

圖3 低溫脅迫下各品種葉片可溶性糖變化Figure 3 Changes of soluble sugar content in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

圖4 低溫脅迫下各品種葉片可溶性蛋白質(zhì)變化Figure 4 Changes of soluble protein content in leaves of six cultivars of O. fragrans under cold stress

2.4 低溫脅迫對(duì)6個(gè)彩葉桂品種葉片保護(hù)酶活性的影響

圖5顯示：隨著低溫脅迫強(qiáng)度增加，各品種超氧化物歧化酶活性變化趨勢(shì)大體分“單峰”和“雙峰”2種形式，但不同品種的峰值所對(duì)應(yīng)的溫度和增長(zhǎng)幅度不同?！_彩1號(hào)’ ‘傲霜’葉片中超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)出“升—降—升—降”的雙峰曲線。這2個(gè)品種第1個(gè)峰值所對(duì)應(yīng)的溫度均為?4 ℃，第2個(gè)峰值對(duì)應(yīng)的溫度分別為?12和?20 ℃；其余各品種均呈先上升后下降的單峰曲線，其中‘冬榮’峰值所對(duì)應(yīng)的溫度最低，為?12 ℃，‘永?；貌省逯邓鶎?duì)應(yīng)的溫度較高，為0 ℃。各品種中，增幅最大的是‘羅彩1號(hào)’，是對(duì)照的2.17倍，增幅最小的是‘傲霜’，是對(duì)照的1.62倍。一般來(lái)說(shuō)，低溫脅迫會(huì)使植株超氧化物歧化酶活性提高，其增幅與植物自身耐寒能力高低具有正相關(guān)性。

圖5 低溫脅迫下各品種葉片超氧化物歧化酶活性變化Figure 5 Changes of SOD activity in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

圖6顯示：不同品種過(guò)氧化物酶活性隨溫度變化趨勢(shì)也大致分為2種類型?！栏；貌省?‘銀碧雙輝’大致呈“上升—下降”的趨勢(shì)，兩者達(dá)到最大值時(shí)臨界溫度均為?8 ℃，但增幅各不相同，峰值時(shí)的過(guò)氧化物酶活性分別是對(duì)照的3.03、4.69倍；‘羅彩1號(hào)’ ‘羅彩2號(hào)’ ‘傲霜’ ‘冬榮’過(guò)氧化物酶活性呈“下降—上升—下降”的趨勢(shì)，在0 ℃時(shí)過(guò)氧化物酶活性均出現(xiàn)短暫下降，隨后立即上升，分別在?4、?8、?4、?12 ℃時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)過(guò)氧化物酶活性分別是對(duì)照的1.12、1.42、1.31、1.19、1.15倍；當(dāng)溫度進(jìn)一步降低時(shí)(?12～?28 ℃)，各品種過(guò)氧化物酶活性又出現(xiàn)大幅度下降。一般來(lái)說(shuō)，過(guò)氧化物酶活性的上升幅度與植物的耐寒能力正相關(guān)。

圖6 低溫脅迫下各品種葉片過(guò)氧化物酶活性變化Figure 6 Changes of POD activity in leaves of six cultivars of O.fragrans under cold stress

2.5 隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)6個(gè)彩葉桂品種的抗寒性

采用Excel 2016，依據(jù)隸屬函數(shù)計(jì)算公式得出6個(gè)品種各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，并取平均值，通過(guò)比較隸屬函數(shù)平均值大小得出6個(gè)品種的抗寒性從強(qiáng)到弱依次為 ‘傲霜’ ‘冬榮’ ‘羅彩2號(hào)’ ‘羅彩1號(hào)’ ‘永福幻彩’ ‘銀碧雙輝’(表2)。

表2 6 個(gè)彩葉桂品種抗寒性綜合評(píng)價(jià)Table 2 Comprehensive evaluation of cold resistance of six cultivars of O. fragrans

3 討論

植物組織的相對(duì)電導(dǎo)率變化能夠在一定程度上反映細(xì)胞膜的受損情況，是檢測(cè)植物耐寒性的較為快速和準(zhǔn)確的指標(biāo)[11]。在植物抗寒性評(píng)價(jià)中常采用電導(dǎo)法，并與 Logistic 方程結(jié)合即能夠較簡(jiǎn)便地篩選出抗性較強(qiáng)的品種[10]。本研究得出：各品種葉片相對(duì)電導(dǎo)率隨溫度的降低而不斷增大，總體呈“S”曲線增長(zhǎng)，不同品種的變化幅度有所差異，與桂花[12]、蘋(píng)果Malus pumila[13]、柑橘Citrus reticulata[14]、繡線菊Spiraea salicifolia[15]、楨楠Phoebe zhennan[16]等植物的結(jié)果一致。將6個(gè)彩葉桂品種相對(duì)電導(dǎo)率擬合Logistic方程計(jì)算得到各品種的半致死溫度并進(jìn)行抗寒性排序，結(jié)果與隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果相同，可見(jiàn)通過(guò)半致死溫度來(lái)判斷此6個(gè)彩葉桂品種抗寒性是可靠的。這在木瓜屬Pseudocydonia[17]、衛(wèi)矛屬Euonymus[11]等植物中也得到了驗(yàn)證。

逆境脅迫下，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度明顯升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著低溫脅迫程度的加重，6個(gè)彩葉桂品種葉片丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，并且在降溫初始階段就開(kāi)始迅速上升，這與相思樹(shù)Acacia[19]的結(jié)果一致。說(shuō)明突然低溫使膜脂發(fā)生過(guò)氧化，膜系統(tǒng)受到損傷。隨著溫度進(jìn)一步降低，丙二醛質(zhì)量摩爾濃度出現(xiàn)一定的下降?？梢?jiàn)適宜的低溫鍛煉能夠維持丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的相對(duì)穩(wěn)定，緩解膜系統(tǒng)遭受的損害，推測(cè)此時(shí)植物體通過(guò)調(diào)動(dòng)自身的調(diào)節(jié)機(jī)制如增加抗氧化酶的活性等來(lái)緩解損傷。對(duì)照超氧化物歧化酶活性變化情況來(lái)看，此時(shí)葉片的超氧化物歧化酶活性處于較高水平，這也可以證明此推測(cè)。隨著低溫脅迫的加深，葉片內(nèi)丙二醛質(zhì)量摩爾濃度再次上升，表明彩葉桂葉片細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度隨溫度的進(jìn)一步降低而逐漸加深，這時(shí)植株的受損程度已經(jīng)較為嚴(yán)重，僅依靠自身已經(jīng)很難調(diào)節(jié)。

低溫環(huán)境中植物細(xì)胞會(huì)大量積累各類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)等)，其增加幅度和積累速度與自身抗寒性密切相關(guān)，抗寒性越強(qiáng)的植物增幅越大[20?21]。在對(duì)彩葉桂葉片進(jìn)行人工低溫處理時(shí)，各品種可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體上均表現(xiàn)出“升高—降低”的變化趨勢(shì)，但增加幅度和拐點(diǎn)溫度并不相同，這與北美冬青Ilex verticillata[18]、8種常綠闊葉樹(shù)[22]的研究結(jié)果類似。推測(cè)在降溫初期，植物體的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制被誘發(fā)，植物能夠合成更多的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)，以降低細(xì)胞滲透勢(shì)，改善自身抗寒能力；溫度進(jìn)一步降低時(shí)，該防御機(jī)制受到影響，葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量開(kāi)始減少?？偟膩?lái)說(shuō)，各彩葉桂品種對(duì)于低溫脅迫造成的傷害均具備一定的防御能力，它們?cè)诘蜏孛{迫下可以合成更多的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)提高細(xì)胞液濃度，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，以應(yīng)對(duì)低溫脅迫造成的傷害，但在不同品種間這種防御能力有所差異。

超氧化物歧化酶與過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶。植物遭受低溫脅迫時(shí)，抗氧化酶活性上升[23?25]。本研究中隨著低溫脅迫強(qiáng)度的增加，各品種間超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性的變化有所不同。‘羅彩2號(hào)’ ‘冬榮’的超氧化物歧化酶活性及‘永?；貌省?‘銀碧雙輝’超氧化物歧化酶與過(guò)氧化物酶活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，但不同彩葉桂品種超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性最大值所對(duì)應(yīng)的溫度和增長(zhǎng)的幅度各不相同。在降溫初期，2種酶活性均有一定程度的增加趨勢(shì)，可見(jiàn)植株對(duì)初期微弱的低溫即產(chǎn)生了一定的防御能力來(lái)緩解損傷的速度和程度，證明了超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶具有保護(hù)植物抵御低溫脅迫的功能。隨著溫度的繼續(xù)降低，脅迫進(jìn)一步加深，即超氧陰離子自由基大量累積，超出了植物自身防御系統(tǒng)的清除能力，而且保護(hù)酶系統(tǒng)被破壞，超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶活性急劇下降。本研究結(jié)果與蘋(píng)果砧木[26]、野生柑橘[27]、黃連木Pistacia chinensis和黃山欒樹(shù)Koelreuteria integrifoliola[28]的結(jié)果一致?！_彩1號(hào)’‘傲霜’葉片中超氧化物歧化酶活性表現(xiàn)出“上升—下降—再上升—再下降”的趨勢(shì)，中間出現(xiàn)波動(dòng)的原因可能是隨著溫度的進(jìn)一步降低，植物的防御機(jī)制受到輕微破壞，體內(nèi)超氧化物歧化酶活性出現(xiàn)降低，自由基大量積累，葉片受害加深。隨著脅迫的加深，超氧化物歧化酶活性有回升的趨勢(shì)，但很快到達(dá)保護(hù)極限，之后再次下降。本研究結(jié)果與葡萄Vitisvinifera[29]、楊桃Averrhoa carambola[30]的研究結(jié)果一致?！_彩1號(hào)’‘羅彩2號(hào)’‘傲霜’‘冬榮’過(guò)氧化物酶活性呈“下降—上升—下降”的趨勢(shì)，在降溫初期過(guò)氧化物酶活性即出現(xiàn)降低的原因可能是低溫脅迫已經(jīng)對(duì)植株產(chǎn)生了輕微的損傷，當(dāng)溫度繼續(xù)下降時(shí)(0～?12 ℃)，植株過(guò)氧化物酶活性有一定回升，說(shuō)明植物體能夠借助自身的調(diào)節(jié)來(lái)減輕逆境所造成的傷害。隨著溫度的進(jìn)一步下降(?12～?28 ℃)，低溫脅迫對(duì)植物的損傷已經(jīng)超越了植物體自我調(diào)節(jié)能力的限度，過(guò)氧化物酶活性便再次下降。本研究結(jié)果與葡萄[31]、多脈含笑Michelia coriacea[32]的結(jié)果一致。

綜上所述，低溫脅迫條件下，6個(gè)彩葉桂品種葉片生理生化指標(biāo)發(fā)生了明顯的變化。據(jù)其變化趨勢(shì)推測(cè)彩葉桂應(yīng)對(duì)低溫脅迫的作用機(jī)制主要為：一是通過(guò)合成和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì)，二是通過(guò)抗氧化酶清除逆境下過(guò)多的活性氧自由基。隸屬函數(shù)法[10]可以克服單一生理指標(biāo)的片面性，能夠更加全面地反映植物的實(shí)際抗寒性，得到更為準(zhǔn)確可靠的評(píng)價(jià)結(jié)果。目前，隸屬函數(shù)法已經(jīng)在毛桃Amygdalus persica[33]、枇杷Eriobotrya japonica[34]、非洲菊Gerbera jamesonii[35]等植物的抗寒性研究上廣泛應(yīng)用。采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)6個(gè)彩葉桂品種的抗寒能力，強(qiáng)弱順序依次為‘傲霜’ ‘冬榮’‘羅彩2號(hào)’ ‘羅彩1號(hào)’ ‘永?；貌省?‘銀碧雙輝’。這與各品種田間越冬表現(xiàn)觀察結(jié)果較為一致，其中‘傲霜’‘冬榮’‘羅彩2號(hào)’這3個(gè)品種較能適應(yīng)北方氣候。