松材線蟲侵染對(duì)馬尾松苗不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

尹詩(shī)恒，張紹勇，劉骕骦，吳酬飛2,，王俊偉，李 陽2,，張立欽2,

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 湖州師范學(xué)院 浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000；3. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000；4. 煙臺(tái)市昆崳山林場(chǎng)，山東 煙臺(tái) 264100）

馬尾松Pinus massoniana為松科Pinaceae松屬Pinus的常綠大喬木，最高達(dá)45 m，樹皮呈紅褐色，多見于中國(guó)南方[1?2]。馬尾松是中國(guó)松屬中占比最大的一類樹種，因其速生和耐貧瘠的特點(diǎn)成為經(jīng)濟(jì)效益較大的用材樹種之一[3]。松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus病又稱松樹萎蔫病，其擴(kuò)散途徑主要為人類行為傳播和松墨天牛Monochamus alternatus攜帶傳播2種[4]，且擴(kuò)散速度快，危害程度極高，對(duì)林業(yè)經(jīng)濟(jì)和森林資源造成了極大損失[5]。因馬尾松侵染初期并不表現(xiàn)任何特征，一旦發(fā)病則植物開始枯萎且無法救治，最終死亡，所以松材線蟲病也被稱為“森林癌癥”[6]。松材線蟲病的早期研究主要集中于致病機(jī)制[7]；后隨科技和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，化學(xué)和物理防治研究逐步取得進(jìn)展[8]；近年來，由于環(huán)境問題日益突出，生防研究逐漸受到重視，尤其對(duì)植物體內(nèi)生防細(xì)菌的研究與應(yīng)用。談家金等[9]通過水培離體松枝得到1株堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌Bacillus firmus GD2，可影響松材線蟲病的侵染，首次證明莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌與松材線蟲病之間有密切聯(lián)系。袁文婷[10]從馬尾松與黑松Pinus thunbergii莖部分離到9株內(nèi)生細(xì)菌，其中3株對(duì)部分病原菌有一定拮抗作用。CARRELL等[11]、IZUMI等[12]在柔松Pinus flexilis、歐洲赤松Pinus densiflora的根部與根際發(fā)現(xiàn)了大量不同種類的內(nèi)生細(xì)菌。胡振亮等[13]從健康油松Pinus tabuliformis根部、木質(zhì)部、韌皮部及松針等7個(gè)部位分離到40株內(nèi)生細(xì)菌，其中1株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis可對(duì)松樹枯梢病Sphaeropsis sapinea起到抑制作用。李陽[14]對(duì)健康馬尾松接種清水處理與空白對(duì)照，證實(shí)了接種產(chǎn)生的機(jī)械損傷與野外條件變化對(duì)菌群結(jié)構(gòu)并無影響。綜上可知，自2000年以來，對(duì)松科植物內(nèi)生細(xì)菌相關(guān)的研究已取得一定進(jìn)展，但對(duì)馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌的研究并不多，尤其缺乏高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)松材線蟲病侵染后馬尾松內(nèi)生細(xì)菌菌群的研究?；诖耍狙芯坷米冃蕴荻饶z電泳(DGGE)技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)，探究野外接種松材線蟲后馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變化，為松材線蟲病的早期診斷和后期生防菌株的挖掘提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從杭州四季春馬尾松苗圃(30°21′42″N，119°34′51″E)采集30株3年生健康馬尾松幼苗種植于湖州師范學(xué)院試驗(yàn)田中，緩苗15 d后采用套管接蟲法接種24株馬尾松苗，每株接種松材線蟲1萬條。接種當(dāng)天取其中6株未接種苗作為空白對(duì)照，之后每隔15 d取6株接種苗作為試驗(yàn)樣本，共取樣5次，時(shí)間為60 d，其間取侵染15 d的松干樣本進(jìn)行鏡檢，確定松材線蟲已接種成功。其中3株馬尾松幼苗的松干、松針和根系樣本分開裝入自封袋，按順序編號(hào)并保存至?20 ℃冰箱，用于DGGE分析；另外3株試驗(yàn)樣本分裝后按相同順序編號(hào)保存至?80 ℃冰箱中用于高通量測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 松材線蟲的培養(yǎng)與接種 松材線蟲與灰葡萄孢Botrytis cinerea均取自浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，將松材線蟲接種于布滿灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 d，挑選其中密封完好且取食干凈的培養(yǎng)基，采用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲[15]。將分離得到的松材線蟲液以3 500 r·min?1轉(zhuǎn)速下離心3 min，離心后松材線蟲沉積于離心管底部，棄上部液體并將剩余液體混勻，最后加入無菌水與松材線蟲，按比例配制成10 000條·mL?1的線蟲懸液，用于試驗(yàn)田馬尾松苗接種。

1.2.2 DGGE技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增：采用磁珠法細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒分別提取松干、松針與根系總細(xì)菌的DNA后，選用BIO-RAD的T100TM Thermal Cycler PCR儀對(duì)細(xì)菌DNA的16S V3區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增選擇帶有 GC 夾的細(xì)菌特異性引物 GC-341(cgc ccg ccg cgc gcg gcg ggc ggg gcg ggg gcg cgg ggg gcc tac ggg agg cag cag)與 518R(att acc gcg gct gg)進(jìn)行，其產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后存至?20 ℃冰箱備用。

DGGE凝膠電泳：首先，分別吸取9.6 mL體積分?jǐn)?shù)100%與6.4 mL體積分?jǐn)?shù)0的變性膠、6.4 mL體積分?jǐn)?shù)100%與9.6 mL體積分?jǐn)?shù)0的變性膠于2個(gè)錐形瓶中，再次吸取80 μL的過硫酸銨(AP)與16 μL的四甲基乙二胺(Temed)均加至上述2個(gè)錐形瓶中，配制成體積分?jǐn)?shù)為60%與40%的梯度膠，分別倒入梯度膠電動(dòng)生成器進(jìn)行灌膠，梯度膠凝固后吸取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與5 μL loading buffer混合后進(jìn)行點(diǎn)樣。其次，將點(diǎn)樣完成的凝膠放入已預(yù)熱至60 ℃的電泳儀中，80 V電泳13 h。最后待電泳完畢向凝膠倒入0.5 μL染色劑避光染色，用BIO-RAD凝膠橙色系統(tǒng)獲取DGGE電泳條帶圖。將DGGE電泳條帶圖導(dǎo)入Quantity One軟件中進(jìn)行DGGE圖譜分析，并利用PAST生物統(tǒng)計(jì)軟件與WPS軟件處理數(shù)據(jù)圖表，分析不同部位受松材線蟲侵染后內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異。

1.2.3 高通量測(cè)序技術(shù) 委托諾禾致源生物科技有限公司對(duì)樣本細(xì)菌的DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq。首先，采用CTAB法對(duì)樣本的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，選擇帶有Barcode的特異引物515F與806R對(duì)樣本16S V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，使用體積分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后對(duì)目的條帶進(jìn)行回收。其次，使用 TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)Qubit和Q-PCR定量后使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序得到數(shù)據(jù)。最后，使用FLASH對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列后，在97%的相似性水平上，使用Uparse軟件進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，通過Qiime軟件和R軟件對(duì)樣本進(jìn)行群落多樣性分析，同時(shí)對(duì)比DGGE數(shù)據(jù)，定性定量對(duì)內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異變化進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的DGGE分析

2.1.1 不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的DGGE電泳條帶分析 如圖1所示：松針部位空白對(duì)照組(即侵染0 d)和侵染15 d的樣品條帶數(shù)量和亮度基本不變，侵染30 d后條帶數(shù)量增多且亮度加深，侵染45 d后條帶的亮度和數(shù)量進(jìn)一步增加，但侵染60 d后，條帶的數(shù)量減少且亮度減弱。松干部位不同侵染期樣品的條帶數(shù)量和亮度差異最大，侵染15 d后樣品條帶即開始變化，侵染30 d后其數(shù)量與亮度明顯增加且到達(dá)高峰；至侵染后期，條帶整體變化不明顯，但條帶數(shù)量有一定的減少，且部分條帶明顯增亮或減弱。相比松干與松針，根系的變化非常小，不同侵染期條帶的數(shù)目與亮度均無明顯變化，整體相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 不同時(shí)期馬尾松內(nèi)生細(xì)菌菌群變化的DGGE分析圖Figure 1 DGGE analysis chart of changes in the endophytic bacterial flora of P. massoniana in different periods

2.1.2 不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的差異顯著性分析 如圖2所示：松干部位侵染0與60 d樣本數(shù)據(jù)的離散程度最小，中位數(shù)約20；侵染30 d數(shù)據(jù)最大值可達(dá)80，數(shù)據(jù)離散程度極大，中位數(shù)約60；侵染15與45 d的樣本數(shù)據(jù)離散程度中等，中位數(shù)約30，其中P=0.000 8，小于0.05。松針部位各組數(shù)據(jù)的離散程度相近，除侵染0與45 d樣本的中位數(shù)接近70，剩余3組數(shù)據(jù)中位數(shù)約20，其P=0.089 8，大于0.05。根系部位數(shù)據(jù)的離散程度最小，除空白對(duì)照外，不同侵染期樣本中位數(shù)均接近60，且P=0.714 4，大于0.05。

圖2 不同時(shí)期馬尾松內(nèi)生細(xì)菌菌群的差異箱式圖Figure 2 Box diagram of differences in endophytic bacterial flora of P. massoniana in different infection stages

綜上可知：根系部位物種多樣性整體離散程度最小，差異不顯著(P＞0.05)；松干部位整體離散程度最大，且各組數(shù)據(jù)間的離散程度差異也較大，差異顯著(P＜0.05)；松針部位整體離散度介于松干與根系之間，但各組數(shù)據(jù)間的離散程度基本一致，差異顯著(P＜0.05)。

2.1.3 不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的多樣性指數(shù)分析 利用PAST軟件對(duì)條帶數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到不同侵染時(shí)期馬尾松內(nèi)生細(xì)菌菌群的多樣性指數(shù)，即香農(nóng)威納指數(shù)(Shannon-Wiener)、均勻度指數(shù)(Pielou)以及豐富度指數(shù)(Margalef)。如表1所示：隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)，松干的Shannon-Wiener指數(shù)由1.93上升到3.12，Margalef指數(shù)由1.01到3.27；松針的Shannon-Wiener指數(shù)從2.06到2.73，Margalef指數(shù)由1.02到1.85，與松干部位變化趨勢(shì)一致；根系部位的多樣性數(shù)值遠(yuǎn)大于松針與松干部位，但數(shù)值間的差值極小。由此可知，隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)，松干和松針部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的多樣性都呈先增加后減少的變化趨勢(shì)；根系部位的菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化極小，但多樣性最豐富。

表1 不同時(shí)期馬尾松內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of diversity index of the endophytic bacterial community structure of P. massoniana in different periods

2.2 馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的高通量測(cè)序分析

2.2.1 不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的 OUTs聚類分析

由OTUs維恩圖(圖3)可知：根系部位菌群的OTU數(shù)最多，為4 523，且隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)，OTU數(shù)無明顯變化趨勢(shì)；松針與松干菌群的OTU總數(shù)分別為3 833和3 823，且隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，其中侵染15 d的松干部位特有OTU數(shù)由48突增至154，變化最大。這與DGGE圖譜分析結(jié)果相同，即松干與松針條帶數(shù)目在空白對(duì)照組極少，且隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多；菌群多樣性變化與條帶數(shù)目相同，即松干被侵染15 d菌群結(jié)構(gòu)多樣性明顯增多，而松針部位菌群則隨侵染時(shí)間變化逐漸增多。可見，在長(zhǎng)期侵染過程中，松材線蟲的侵染確實(shí)對(duì)不同部位細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化有較大影響，其中松干部位對(duì)松材線蟲病的侵染敏感性最強(qiáng)，響應(yīng)速度最快；松針次之，根系則基本不受侵染影響。

圖3 不同部位內(nèi)生細(xì)菌的 OTUs維恩圖Figure 3 Venn diagram of OUTs of endophytic bacteria in different parts

2.2.2 不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群的物種組成分析 綜上可知，DGGE與高通量測(cè)序結(jié)果一致，DGGE分析能夠直觀地比較和分析馬尾松不同部位細(xì)菌群的結(jié)構(gòu)差異，可對(duì)菌群進(jìn)行定性分析，但無法直接檢測(cè)到菌群的種類，仍需配合其他實(shí)驗(yàn)方法如T克隆。高通量測(cè)序技術(shù)則憑借其大量、速度、準(zhǔn)確的特點(diǎn)可直接檢測(cè)到較全面的馬尾松菌群信息。本研究檢測(cè)到馬尾松體內(nèi)細(xì)菌共442屬，隸屬于35門49綱110目210科。

由圖4可知：在門水平上，相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌分別為藍(lán)藻細(xì)菌門Cyanobacteria、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉菌門Planctomycetes、綠彎菌門Chloroflexi、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、疣微菌門Verrucomicrobia及裝甲菌門Armatimonadetes，其中分布最廣、種類最多的是放線菌門與變形菌門。

圖4 門水平上排名前 10的物種相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundance of the top 10 species at the phylum level

由圖5可知：在屬水平上，松干部位侵染0與15 d菌群的種類相差非常大，如Bryobacter屬、Pseudolabrys屬、類諾卡氏屬Nocardioides、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium與弗萊德門菌屬Friedmanniella，在侵染0 d時(shí)，上述菌群幾乎沒有，侵染15 d后才出現(xiàn)；侵染15～60 d相對(duì)豐度整體變化減弱，但部分菌種如甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、假平胞菌屬Sphingomonas與薄層菌屬Hymenobacter在侵染后期相對(duì)豐度有所增加。與松干相比，松針部位內(nèi)生細(xì)菌菌群種類變化并不明顯，但菌群豐度變化較明顯，如泛菌屬Pantoea與假平胞菌屬隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)豐度整體呈先增加后減少的趨勢(shì)，甲基桿菌屬、假單胞菌屬Pseudomonas、短小桿菌屬Curtobacterium則表現(xiàn)為持續(xù)減少的趨勢(shì)。其余菌屬如藍(lán)藻菌屬Cyanobacteria、伯克氏菌屬Burkholderia、放線菌屬Amnibacterium、變形桿菌屬Gammaproteobacteria、羅思河小桿菌屬Rhodanobacter、拜葉林克氏菌屬Beijerinckiaceae、酸桿菌屬Acidobacteria、嗜麥芽窄食單胞菌屬Stenotrophomonas、溶桿菌屬Lysobacter、慢生根瘤菌屬Bradyrhizobium和節(jié)桿菌屬Arthrobacter則并無明顯豐度變化。根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌群的種類與相對(duì)豐度則始終維持在一定水平。

圖5 屬水平上排名前 30的物種相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of the top 30 species at the genus level

3 結(jié)論與討論

微生物的復(fù)雜培養(yǎng)條件使大部分微生物包括植物內(nèi)生細(xì)菌較難使用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法進(jìn)行研究[16]。雖然松材線蟲病的生防研究已取得一定進(jìn)展，如芽孢桿菌屬Bacillus、短小桿菌屬與區(qū)文氏菌屬Erwinia的生防菌株對(duì)松材線蟲病的侵染可起到一定作用，尤其是芽孢桿菌屬，但其野外生防效果普遍弱于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果[17?18]。本研究通過DGGE技術(shù)對(duì)不同部位的內(nèi)生細(xì)菌分析發(fā)現(xiàn)：松材線蟲的侵入明顯改變了馬尾松內(nèi)生細(xì)菌結(jié)構(gòu)，隨侵染時(shí)間推移菌群多樣性整體表現(xiàn)為先增加后穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，但不同部位內(nèi)生細(xì)菌群的變化規(guī)律并不一致。松干部位內(nèi)生細(xì)菌群在侵染15 d時(shí)產(chǎn)生較大變化，至45 d時(shí)菌群差異達(dá)到顯著，到侵染60 d時(shí)菌群結(jié)構(gòu)與侵染45 d基本一致；而松針部位在侵染30 d才開始表現(xiàn)明顯的菌群變化，且多樣性指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)較平緩；根系部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)在侵染全過程未表現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化，但內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)大于干部與針部。由此可知，內(nèi)生細(xì)菌菌群的物種數(shù)量與豐度從大到小依次為根系、松干、松針；內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異從大到小依次為松干、松針、根系。說明受侵染后松干部位對(duì)松材線蟲病的侵染敏感性最強(qiáng)，其次是松針，根系則基本不受松材線蟲病侵染的影響。

通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)馬尾松不同部位內(nèi)生細(xì)菌定量分析發(fā)現(xiàn)：共檢測(cè)到細(xì)菌442屬，分布于35門49綱110目210科。由OTUs維恩圖分析可知：不同部位內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)與上述結(jié)果一致，即松干部位內(nèi)生細(xì)菌對(duì)松材線蟲病的侵染響應(yīng)最迅速，部分內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)構(gòu)在侵染15 d時(shí)已發(fā)生顯著變化。因此，在松材線蟲傳播的高峰期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)馬尾松的菌群變化對(duì)松材線蟲病的早期檢測(cè)有一定的幫助。此外，松干與松針部位的部分內(nèi)生細(xì)菌相對(duì)豐度也產(chǎn)生了顯著變化，松干部甲基桿菌屬、假平胞菌屬與薄層菌屬隨侵染時(shí)間的增加其相對(duì)豐度顯著增多；而松針部的甲基桿菌屬、假單胞菌屬與短小桿菌屬相對(duì)豐度隨侵染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，泛菌屬與假平胞菌屬則隨侵染時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)豐度呈先增加后減少的變化趨勢(shì)；根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌群的種類與相對(duì)豐度則整體保持穩(wěn)定。

接種植物內(nèi)生菌可刺激植物產(chǎn)生抗性酶，并促進(jìn)植物體內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)的表達(dá)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)防御反應(yīng)[19]。目前，甲基桿菌屬、假平胞菌屬、薄層菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬和短小桿菌屬的部分菌株已從廣泛的生境中分離得到，且已被發(fā)現(xiàn)對(duì)植物具有一定的促生或生防作用。KHAN等[20]研究發(fā)現(xiàn)：假平胞菌屬中的LK11菌株可通過產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)促進(jìn)植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)，刺激植物對(duì)環(huán)境脅迫與病原體產(chǎn)生反應(yīng)，使植物啟動(dòng)防御機(jī)制，提高植物抗性；甲基桿菌屬、泛菌屬也可促進(jìn)植物分泌細(xì)胞分裂素(CK)、吲哚乙酸等植物激素以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，并幫助植物抵擋生物和非生物因素的侵害[21?22]；薄層菌屬與假單胞菌屬也具有解磷酸鈣、產(chǎn)鐵載體等的生物特性，鐵作為植物存活和繁殖的必需微量營(yíng)養(yǎng)素，當(dāng)達(dá)到一定含量即可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，從而提高植物的抗性[22?24]。雖然上述細(xì)菌屬在馬尾松病害防治研究中報(bào)道較少，但已證實(shí)對(duì)其他植物的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的促進(jìn)或阻礙作用，尤其是假單胞菌屬與泛菌屬的部分菌株對(duì)松材線蟲病具有生防效果[25]。綜上，推測(cè)上述細(xì)菌屬中的部分菌株可對(duì)松材線蟲病產(chǎn)生生防作用，為后期發(fā)掘新型生防菌株提供研究方向。