吳小勝，崔廷婷，王兆芹，惠光鵬，趙正苗，萬宇平

可同時(shí)檢測毒死蜱、異菌脲殘留的熒光試紙條研制及其應(yīng)用

吳小勝1,2，崔廷婷1,2，王兆芹1,2，惠光鵬1,2，趙正苗1,2，萬宇平2*

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京）

本文利用毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體，研制出一種能夠檢測果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中毒死蜱、異菌脲的熒光免疫層析矩陣試紙條。毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料0.5 mg/kg，根莖類加工副產(chǎn)品類飼料1 mg/kg；果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中異菌脲檢測限為5 mg/kg，檢測時(shí)間為5 min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求，試紙條能夠應(yīng)用到基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測，具有實(shí)際意義，并且未見同時(shí)檢測毒死蜱、異菌脲的二合一熒光免疫層析試紙條的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，具有創(chuàng)新性。

毒死蜱；異菌脲；熒光免疫層析試紙條；快速檢測

毒死蜱和異菌脲均屬于果蔬中典型殘留農(nóng)藥，毒死蜱是乙酰膽堿酯酶抑制劑，屬硫代磷酸酯類殺蟲劑，中毒癥狀表現(xiàn)為抽搐、痙攣、惡心、嘔吐等。異菌脲是二甲酰亞胺類高效廣譜、觸殺型殺菌劑，對水生生物有極高毒性，可對水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響，在養(yǎng)殖過程中，動物可能通過飲食攝入，對動物造成傷害，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)。因此，研究開發(fā)毒死蜱和異菌脲的檢測技術(shù)和方法具有重要意義。

目前傳統(tǒng)檢測毒死蜱的儀器方法有比色光譜法[1]、氣相色譜法[2]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、電化學(xué)傳感器法[6]等；傳統(tǒng)檢測異菌脲的儀器方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、氣相色譜法[8-10]、高效液相色譜法[11-12]等。上述儀器方法成本高，用時(shí)較長，而免疫化學(xué)檢測法具有低成本、用時(shí)較短、特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本文制備出一種毒死蜱單克隆抗體和異菌脲單克隆抗體，將其用于制備熒光免疫層析試紙條，費(fèi)用及檢測時(shí)限均能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的檢測需求，該產(chǎn)品已市場化，應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，保證畜產(chǎn)品質(zhì)量，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料，購自北京某超市。

1.1.2 樣品與儀器 毒死蜱、異菌脲等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95 %）購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；時(shí)間分辨熒光微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司；渦旋儀購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱半抗原的制備 毒死蜱原藥與氨基丁酸在四氫呋喃中加熱，反應(yīng)完成后，堿溶解，萃取，水相調(diào)節(jié)pH，萃取，得到粗品，柱層析純化分離，得到半抗原產(chǎn)物[15]。

1.2.2 異菌脲半抗原的制備 以2，6-二氯-4-硝基苯酚為起始原料，經(jīng)烴基化反應(yīng)，硝基還原反應(yīng)，芳香胺的?；磻?yīng)，成環(huán)反應(yīng)，亞胺的?；磻?yīng)以及叔丁酯水解等反應(yīng)，合成了帶有四碳鏈長度的羧基半抗原產(chǎn)物，具體方法如下[16]：

圖1 毒死蜱半抗原合成路線

化合物a的合成：5.0 g 2，6-二氯-4-硝基苯酚與3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中攪拌，加2.6無水碳酸鉀催化，60 ℃ 反應(yīng)8 h。反應(yīng)停止后，蒸出溶劑，加水與乙酸乙酯萃取，有機(jī)層加入無水硫酸鈉干燥，濃縮，過200-300目硅膠柱，用吸附柱色譜進(jìn)行層析分離純化，得到化合物a 5.23 g，收率87 %。

化合物b的合成：鋅粉3.1 g加水20 ml，冰乙酸1 ml，90 ℃ 反應(yīng)30 min，加5.2 g化合物a的乙醇溶液80 ml，60 ℃ 反應(yīng)4 h。停止反應(yīng)，抽濾，蒸干，加水與二氯甲烷萃取，靜置，有機(jī)層加入無水硫酸鈉干燥，石油醚/乙酸乙酯20/1重結(jié)晶，得到化合物b 4.8 g，收率91 %。

化合物c的合成：化合物b 4.7 g加乙腈100 ml溶解，攪拌，加氨基乙酸2.16 g，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，通入碳酰氯，50 ℃ 反應(yīng)7 h。停止反應(yīng)，加氫氧化鈉水溶液50 ml，震蕩，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗滌，濃縮，蒸干，過200～300目硅膠柱，用吸附柱色譜進(jìn)行層析分離純化，得到化合物c 3.57 g，收率73 %。

圖2 異菌脲半抗原合成路線

化合物d的合成：化合物c 3.4 g加1，2-二氯乙烷溶解，加DMF 0.5 ml，加草酰氯3 ml，室溫?cái)嚢? h，旋蒸蒸干，除去有機(jī)溶劑，加吡啶80 ml溶解，80 ℃ 反應(yīng)7 h。停止反應(yīng)，冷卻到室溫，旋蒸，除去吡啶，加乙醇-石油醚（10:3，v/v）加熱溶解，4 ℃ 放置過夜，抽濾，得到化合物d 2.97 g，收率82 %。

化合物e的合成：化合物d 2.8 g加1，2-二氯乙烷200 ml溶解，加異丙胺2.7 ml，通入氮?dú)猓懦諝?，通入碳酰氯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h。停止反應(yīng)，加KOH水溶液50 ml震蕩，靜置，分出有機(jī)相，水洗，無水硫酸鈉干燥蒸干，過200～300目硅膠柱，石油醚/乙酸乙酯（1:1）洗脫分離，得到化合物e 1.53 g，收率64 %。

化合物f的合成：取化合物e 1.53 g，加70 % 甲酸水溶液100 ml溶解，70 ℃ 攪拌反應(yīng)6 h，停止反應(yīng)，旋蒸，除去溶劑，加氫氧化鈉水溶液，加乙酸乙酯萃取，分去有機(jī)相，水相調(diào)節(jié)pH值到4，加1，2-二氯乙烷萃取，水洗，干燥，蒸干，乙醇/正己烷（6:4，v/v）重結(jié)晶，得到白色固體0.81 g，收率77 %。

1.2.3 單克隆抗體的制備 將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原。分別用毒死蜱免疫原、異菌脲免疫原免疫Balb/c小鼠，免疫劑量為150 μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1（數(shù)量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37 ℃ 水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5 ml/只，7 d后腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5×105個(gè)/只，7 d后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20 ℃ 保存。即得到毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體。將1.2.1制備的毒死蜱半抗原、1.2.2制備的異菌脲半抗原分別與卵清白蛋白偶聯(lián)，得到毒死蜱包被原、異菌脲包被原。

1.2.4 制備毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條 1.2.3制備的毒死蜱單克隆抗體、異菌脲單克隆抗體分別用熒光微球標(biāo)記，具體方法如下：（1）取熒光微球懸液100 μl混懸于900 μl活化緩沖液中，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸微球于1 ml活化緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入適量活化劑，混勻后室溫震蕩活化10 min；（2）將（1）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于偶聯(lián)緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入10～20 μl抗毒死蜱單克隆抗體溶液/異菌脲單克隆抗體溶液（蛋白濃度1 mg/ml），混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120 min；（3）將（2）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于封閉緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后室溫震蕩封閉30 min；（4）將（3）所述混懸液于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min后棄上清，重懸于貯存緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后于4 ℃ 避光保存。將上述熒光微球標(biāo)記的抗體分別噴涂到試紙條的結(jié)合物釋放墊上，在檢測線1（T1線）上包被毒死蜱包被原，在檢測線2（T2線）上包被異菌脲包被原；在質(zhì)控線（C線）上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結(jié)構(gòu)，制備出毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條。

1.2.5 檢測方法 檢測前樣品應(yīng)恢復(fù)至室溫，取新鮮樣品擦去泥土，剪碎成小于1 cm見方的碎片。稱取1.00 ± 0.05 g樣品至15 ml聚苯乙烯離心管中，再加入5 ml提取液，蓋上蓋子，手動上下振蕩30s，靜置1min，得樣品溶液。

用吸管吸取上述樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔，液體流動時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min，通過熒光分析儀讀取檢測結(jié)果。其它時(shí)間判讀無效。

圖3 毒死蜱、異菌脲殘留二合一熒光試紙條

1.2.6 樣本檢測限 在空白白菜樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.5所述方法用三批試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測限[17]。

1.2.7 試紙條的特異性 《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：采用與待檢藥物同類藥物、類似物或可能聯(lián)合使用的藥物測定特異性，因此，分別配制10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物，用試紙條重復(fù)檢測3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.8 準(zhǔn)確性 農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準(zhǔn)確性[17]。取經(jīng)儀器確證的50份陰性果蔬樣品（質(zhì)量濃度小于檢測限），50份陽性果蔬樣品（質(zhì)量濃度大于檢測限），用該試紙條進(jìn)行檢測毒死蜱、異菌脲藥物殘留，計(jì)算假陽性率和假陰性率[17]。《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5 %，假陰性率應(yīng)為零[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測限

在空白白菜樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白馬鈴薯樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜樣本以及皇冠梨樣本中分別添加異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.6步驟進(jìn)行檢測，確定檢測限[17]。檢測白菜中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.25 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1.0 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于0.5 mg/kg濃度的毒死蜱白菜樣本；檢測馬鈴薯中毒死蜱濃度為0 mg/kg、0.5 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于1.0 mg/kg濃度的毒死蜱馬鈴薯樣本；檢測白菜中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲白菜樣本；檢測皇冠梨中異菌脲濃度為0 mg/kg、2.5 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陰性結(jié)果，濃度為5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg時(shí)，試紙條呈現(xiàn)陽性結(jié)果，即試紙條能夠檢測出大于等于5 mg/kg濃度的異菌脲皇冠梨樣本。由此可知，該試紙條的檢測限為：毒死蜱檢測限為白菜0.5 mg/kg，馬鈴薯1 mg/kg；白菜和皇冠梨中異菌脲檢測限為5 mg/kg，見表1。

表1 毒死蜱、異菌脲二合一試紙條的檢測限

注：- 表示陰性，+ 表示陽性。

2.2 特異性

該試紙條檢測10 mg/kg的腐霉利、啶蟲脒、滅蠅胺等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準(zhǔn)確性

用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5 %；用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求[17]。

表2 特異性測定

表3 準(zhǔn)確性測定

2.4 關(guān)于動物飼料方面檢測的適用性

由于市場需求，本研究暫時(shí)只測定了白菜、馬鈴薯、皇冠梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本，后續(xù)研究會增加樣本進(jìn)行測定。本研究制備的農(nóng)藥殘留熒光免疫層析矩陣試紙條，只需根據(jù)樣本特點(diǎn)調(diào)整其前處理方法，即能夠檢測出該樣本的農(nóng)藥殘留量，因此，本試紙條對于其他動物飼料方面的檢測，同樣適用。

3 結(jié)論

本文制備出的毒死蜱、異菌脲半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原，最終制備出商品化的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《獸藥殘留檢測試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》要求，對試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時(shí)間僅為5 min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時(shí)更短，操作更簡便。試紙條對毒死蜱檢測限為葉菜類加工副產(chǎn)品類飼料樣本0.5 mg/kg，根莖類加工副產(chǎn)品類飼料樣本1 mg/kg；果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本中異菌脲檢測限為5 mg/kg，靈敏度較高。該方法作為一種快速篩查手段，可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場篩查和檢測，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。

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（2021–03–24）

S818.9

A

1007-1733（2021）08-0013-06

典型性農(nóng)殘多靶標(biāo)高效快速檢測技術(shù)研究與應(yīng)用（Z181100009318006）項(xiàng)目資助